巴比妥缓冲液在薄膜电泳提取染色液的作用作用

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-11-16 05:43 标签： 薄膜电泳提取染色液的作用

本法是以醋酸纤维素薄膜为支持介质的区带电泳。醋酸纤维素是指纤维素羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时问短，样品用量少，使蛋白质可得到满意的分离效果。现已为中国药典等药品标准中人血白蛋白及人血丙种球蛋白纯度检查的法定方法，取代了早期使用的纸电泳法。

醋酸纤维素薄膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化，有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。

电泳室及直流电源同纸电泳。

①取醋酸纤维素薄膜，裁成2—8cm的膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液(pH 8.6)中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后，将膜条无光泽面向上，置电泳槽架上，经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH 8.6)中。

②点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含量约5％的供试品溶液2—3μ1，在lO～12V／cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4～5 cm为宜。

③染色 电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑染色液中，2—3分钟后，用漂洗液浸洗数次；直至脱去底色为止。

④透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10～15分钟，取出平铺于清净的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度计上测定和作标本长期保存。

⑤含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各品种项下规定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对含量(％)。

a．洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于1.6％的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全，于一定波长下测定吸光度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位，同法操作作对照。先计算吸收值总和，再计算各蛋白组分所占比率(％)。

b．扫描法将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，横坐标为膜条的长度，纵坐标为吸光度，计算各蛋白质组分的含量(％)。亦可用微机处理积分计算。

1.学习醋酸纤维薄膜电泳原理。

2.掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的技术。

3.熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中蛋白与球蛋白的比值。

血清绝大多数蛋白质的等电点在pH5.0～7.0。在pH8.6的巴比妥缓冲液中，

血清蛋白全部带负电荷，在直流电场中向正电极移动，移动的速度与带电蛋白质颗

粒所带电荷成正比，与蛋白质颗粒的大小成反比。如果样品点在醋酸纤维薄膜的同

一条线上，电泳相同的时间，不同的蛋白质颗粒移动的距离不同，通过染色，薄膜

条上的血清的蛋白质被分离成不同的条带。将此薄膜条透明，可以进行扫描，或将

色带剪下，将颜色洗脱，进行比色，都能获得各色带所含蛋白质占血清总蛋白的百

分比，并可计算血清中清蛋白／球蛋白比值，正常值为1.5～2.5。

（三）实验材料与仪器：

1．实验仪器材料：1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）2、人血清；3、烧杯及培养皿数只；4、x光片；5、镊子；6、试管六只；7、电泳槽；8、

直流稳压电泳仪；9、7220型分光光度计；10、剪刀

2．实验试剂：1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中；2、染色液，可反复使用；3、漂洗液：取

取一条醋酸纤维薄膜，侵入缓冲液中，完全侵泡后，用镊子轻轻取出，将薄膜

无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液。

用X光片蘸取少量血清，然后轻轻于距离薄膜端1.5cm处接触，样品即成一条

线突于纤维膜上。待血清透入膜内，将薄膜放在电泳槽上。

接通电源，设定电泳电压为100V，通电50min.

电泳完毕后，将薄膜侵泡在染色液中5min～10min.取出，用漂洗液漂至背景

取出六只试管，将漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取

一条与各区带相近似宽的无蛋白质附着的空白薄膜，分别侵泡于4.0ml 0.4mol/L

NaOH 溶液中，然后用7200型分光光度计在650nm处比色，以空白条薄膜洗出液为空白调零，测定各管的吸光度。

实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins） 实验目的 1、掌握电泳法分离蛋白质的原理 2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的 原理和操作方法 3、学习蛋白质染色的方法 分离蛋白质的方法 分离方法 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 超速离心法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 实验原理 电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。 以蛋白质为例： H＋ OH－ H＋ OH－ pH>pI pH=pI pH<pI 影响电泳迁移率的因素： 1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离 子强度和电渗现象 常见的电泳有： 1、醋酸纤维膜电泳、 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 3、毛细管电泳 负极 正极 － － － － － － － － 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。 电渗作用： 电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 以纸电泳为例: 血清中几种主要蛋白组分： 血清蛋白质　　　　　　　　　　 等电点 分子量 占总蛋白的％ 清蛋白　　　　 　　　　　　　　 4.64　 69,000 57～72 α1－球蛋白　　 　　　 　　　　 5.00　 200,000 2～5 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.1～0.15mm 染色剂 一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色 实验器材 1、电泳仪及电泳槽 2、醋酸纤维薄膜（2×8cm） 3、培养皿 4、点样器（盖玻片） 5、滤纸 6、玻璃板（可用大培养皿背面代替） 7、镊子 8、毛细管 9、刀片 实验试剂 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L，离子强度0.06) 2、0.5%氨基黑10B染色液 3、漂洗液100ml 4、透明甲液和乙液各20ml 5、人血清（严格防止血清沾到皮肤上，尤其是带有伤口的皮肤） 实验操作 1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后，取醋酸纤维素薄膜放在滤纸中并吸干表面液体。整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。 2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成滤纸桥。 3.点样： 点样前，取一张干净的滤纸，在距一边1.5cm处用铅笔划一条平行线作为点样标志区。 点样时，用毛细管吸取血清，在盖玻片一端均匀涂抹，使样品连续、均匀、适量，把盖玻片在薄膜毛面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置） 点样区 6.5cm 1.5cm 4.电 泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度（8片薄膜则为4.8mA）。通电10-15min后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度（8片薄膜则为8mA），电泳时间50-80mi

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