测定褪黑素和维生素b6的高效液相色谱分析方法
1.本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种高效快速测定组方中褪黑素和维生素b6含量的液相色谱分析方法。

no3.hcl)是一种水溶性维生素，又叫吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，白色或尅白色结晶或结晶性粉末，无臭，遇光渐变质，在空气中稳定；易溶于水，在乙醇中微溶，在酸性水溶中下稳定，碱性溶液中易破坏。维生素b6在人类生长发育过程中，发挥着非常重要的生理作用，为人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其与氨基酸代谢密切相关。
3.褪黑素(分子式为c
o2)又叫褪黑激素，是一种能使皮肤色素颜色变浅的激素物质，是由必需氨基酸色氨酸合成而来，白色类白色结晶粉末，易溶于甲醇，对光线敏感，对空气敏感，易氧化，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等特性。
4.目前褪黑素和维生素b6的含量测定方法包括放射免疫(ria)法、酶联免疫(hjsa)法、紫外分光光度(uv)法、气相色谱(gc)法和气相色谱-质谱联用(gc-ms)法、高效液相色谱(hplc)法、高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)法、毛细管电泳法、化学发光法、微生物法等。放射免疫(ria)法、酶联免疫(hjsa)法、微生物法样品前处理相对繁琐，检测周期长；由于褪黑素的挥发性不好，采用气相色谱(gc)法和气相色谱-质谱联用(gc-ms)法检测样品前，需要对样品进行衍生化前处理，操作过程冗长，重复性差；紫外分光光度(uv)法、毛细管电泳法、化学发光法专属性较差；高效液相色谱(hplc)法或高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)法在检测褪黑素和维生素b6较常用，但一般是一种方法检测一个组分，复方制剂就需要进行多次检测，才能得到准确结果，对人力物力造成很大浪费；而且检测过程中经常会使用离子对、三乙胺等试剂，严重影响精密仪器和色谱柱的使用寿命；因此，很有必要研究一种高效准确快速低成本且能同时测定复方组分中褪黑素和维生素b6的液相色谱方法。

5.为克服上述问题，本发明提供一种前处理简单，成本较低，准确度高，专属性强、重复性好、快捷的褪黑素和维生素b6的高效液相色谱分析方法，所述方法包括以下步骤：
6.一种用于测定片剂、粉剂、胶囊剂型产品中褪黑素和维生素b6含量的高效液相色谱分析方法，供试品的提取溶剂为含水溶液，提取方法为超声提取；流动相a为甲醇，流动相b为磷酸盐缓冲溶液，梯度洗脱，流动相a和流动相b梯度变化如下：起始比例为甲醇的体积含量10％，磷酸盐缓冲溶液体积含量90％；2-2.01min,甲醇的体积含量由10％变为50％，磷酸盐缓冲溶液体积含量由90％变为50％；2.01-8min，甲醇的体积含量保持为50％，磷酸盐缓冲溶液体积含量保持为50％；8-8.01min,甲醇的体积含量由50％变为10％，磷酸盐缓冲溶液体积含量由50％变为90％；8.01-13min,甲醇的体积含量保持为10％，磷酸盐缓冲溶液体积含量保持为90％。在本发明中，流速0.8～1.5ml/min，优选0.8-1.2ml/min。在本发明
中，紫外检测波长设定为210～279nm，优选260～279nm。
7.在本发明中，用于供试品的提取溶剂选自甲醇溶液、水或盐酸溶液中的一种，优选盐酸溶液。其中，提取溶剂的浓度选自0.001mol/l-0.1mol/l，优选0.005mol/l-0.05mol/l，更优选0.01mol/l。
8.在本发明中，提取方法是水浴超声，水浴超声的温度选自25～60℃，优选30～50℃，更优选35～45℃。
9.在本发明中，流动相b的磷酸盐缓冲溶液为0.05～0.1m磷酸二氢钾和0.005～0.01m磷酸氢二钾的混合溶液，优选0.1m磷酸二氢钾和0.01m磷酸氢二钾的混合溶液。混合溶液的ph选自3.00～5.00，优选3.50～4.50，更优选4.00。
10.在本发明实施方案中，进行上述色谱分析的色谱仪器及条件为：
11.检测仪器：高效液相色谱仪(thermo u3000)，配备紫外检测器；
150mm，5μm)或效能相当的色谱柱，流动相：磷酸盐缓冲液-甲醇；检测波长：210～279nm；流速：0.8～1.5ml/min；柱温：25～30℃，最佳柱温：30℃；运行时间：13min。
14.本发明中，采用高效液相色谱对褪黑素维生素b6片溶液中的褪黑素和维生素b6进行定量检测，需要对该方法进行专属性、准确度等多方面的确认，具体为：
15.专属性：配制褪黑素维生素b6片溶液和不含褪黑素维生素b6的空白辅料溶液，分别进样，结果显示表明空白溶剂、空白辅料对供试品溶液的主峰出峰无干扰，且能与相邻峰有效的分离开，说明本发明提供的方法能够准确测定褪黑素维生素b6片功效成分褪黑素维生素b6的含量。
16.准确度：采用本发明的高效液相色谱方法对褪黑素维生素b6片溶液中的褪黑素维生素b6进行检测，结果显示表明其回收率在合格标准范围，准确度良好。
17.线性：采用本发明的高效液相色谱方法对褪黑素维生素b6片中的褪黑素维生素b6对照品溶液进行检测，在线性范围40％～160％内，结果显示其主成分线性相关系数不小于0.99，表明检测结果与褪黑素维生素b6的浓度具有良好的线性关系。
18.本发明中，采用高效液相色谱对不同剂型样品配制成的样品溶液中的褪黑素维生素b6进行定量检测。
19.图1示对照品溶液的hplc检测的色谱图；
20.图2示实施例1的色谱条件下hplc检测的色谱图；
21.图3示实施例2的色谱条件下hplc检测的色谱图；
22.图4空白辅料示实施例1的色谱条件下hplc检测的色谱图；
23.下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明，分别以片剂、胶囊的选择为例。试剂：甲醇(sinence，批号)，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾(天津市大茂化学试剂厂，ar)，磷酸(天津市富宇精细化工有限公司，ar)，褪黑素对照品(北京北纳创联生物技术研究
院)，维生素b6对照品(中国食品药品检定研究院)，样品(深圳芙莱特营养与健康有限公司)
25.深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的褪黑素维生素b6片样品中褪黑素维生素b6含量的测定。第一实施例的具体步骤如下：
26.第一步：提取溶剂，量取盐酸0.9ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
27.第二步：磷酸盐缓冲溶液：称取磷酸二氢钾13.6g，磷酸氢二钾1.72g，加水至1000ml，搅拌使溶解，磷酸调节ph至3.50，抽滤，即得。
28.第三步：对照品溶液的配制，精密称取褪黑素对照品11.0mg，维生素b6对照品24.0mg[约相当于维生素b6(吡哆醇)20mg]，置100ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸溶液50ml，超声(45℃)使溶解，冷却至室温，加0.01mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为褪黑素、维生素b6混合对照品贮备液；精密量取褪黑素、维生素b6混合对照品贮备液5.0ml，置于50ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。
第四步：样品溶液配制，取本品20片，研细，精密称取适量(约相当于褪黑素1.12mg、维生素b6(以吡哆醇计)2mg)，置100ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸溶液50ml，超声(45℃)10min，冷却至室温后，再加0.01mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
第五步：液相色谱条件的具体内容如下：
流动相：甲醇-磷酸盐缓冲溶液梯度洗脱，洗脱梯度如下：
检测色谱图如图2，检测结果如表1
名称保留时间/min理论塔板数拖尾因子含量％褪黑素2.93.21维生素b66.97.40
深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的褪黑素维生素b6软胶囊样品中褪黑素维生素b6含量的测定。具体步骤：
第一步：提取溶剂，量取盐酸0.9ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
第二步：磷酸盐缓冲溶液：称取磷酸二氢钾6.8g，磷酸氢二钾0.86g，加水至1000ml，搅拌使溶解，磷酸调节ph至4.00，抽滤，即得。
第三步：对照品溶液的配制，精密称取褪黑素对照品11.0mg，维生素b6对照品24.0mg[约相当于维生素b6(吡哆醇)20mg]，置100ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸溶液50ml，超声(35℃)使溶解，冷却至室温，加0.01mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为褪黑素、维生素b6混合对照品贮备液；精密量取褪黑素、维生素b6混合对照品贮备液5.0ml，置于50ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。第四步：样品溶液配制，取本品20粒，剪破胶囊皮，取均匀内容物适量(约相当于褪黑素1.12mg、维生素b6(以吡哆醇计)2mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸溶液50ml，超声(35℃)10min，冷却至室温后，再加0.01mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
第五步：液相色谱条件的具体内容如下：
流动相：甲醇-磷酸盐缓冲溶液梯度洗脱，洗脱梯度如下：
检测色谱图如图3，检测结果如表2
名称保留时间/min理论塔板数拖尾因子含量％褪黑素6.105.81维生素b62.91.95
实施例1～2显示，本发明对褪黑素维生素b6口服片剂和软胶囊样品进行检测，褪黑素维生素b6均能在10min以内出峰，峰型好，与其他成分达到基线分离，说明该方法适用于不同剂型的复方组分中褪黑素维生素b6的检测。
以上所述的具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案以及有益效果作了一系列的详细说明。但该说明仅仅是针对本发明的具体实施例而已，凡没有脱离本发明技术基础、原则和精神而作的等效实施例或变更，均应包括在本发明的保护范围之内。

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专利名称：化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法
本发明是一项利用高效液相色谱仪检测化妆品中红霉素的新技术，尤其适用f化妆品中微量抗生素-红霉素的定性及定量分析。
红霉素(Erythromydn)是一种碱性抗生素，为大环内酯类抗菌药物,作为 一种广谱高效的抗菌药物被广 泛应用到药品、饲料、和化妆品中。红霉素对革兰阳性菌，如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌等有 较强的抑制作用；对革兰阴性菌，如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、以及流感嗜血杆菌也有相当的抑制 作用；此外，对支原体、放线菌、螺旋体、立克次体、衣原体、少数分枝杆菌和阿米巴原虫都有抑制作用。 由于其广谱高效的抑菌作用，红霉素被一些化妆品生产厂家，添加到祛痘类产品以达到消炎、祛瘦、除螨 及抗粉刺的0的。但这种药物同时也存在着很多不良反应，《中国药典》规定红霉素针剂仅能静脉内给药， 严禁肌肉注射。若药液不慎漏入皮下或肌肉组织，轻者可引起局部剧烈的疼痛刺激，严重者可导致大片皮 肤坏死、粘连，愈合后常形成疤痕；此外还可阻挠性激素类的肠肝循环；过讨的红霉素能引起腹泻、恶心、 呕吐、胃绞痛、口舌疼痛等，更严重的是长期接触此类药物会导致许多病原微生物产生抗药性，不利于疾 病的治疗。冈此，为保护化妆品消费者的健康安全，建立灵敏、准确、快速的化妆品中红霉素的检测方法 是十分紧迫和必要的。
据各种文献报道，目前药品中红霉素的检测方法主要有抗生素微生物检定法、紫外分光光度法、液相 色谱法、薄层色谱法、化学发光分析、二阶导数差示脉冲极谱法。抗生素微生物检定法是《中国药典》(2000 年版)规定的检铡药品中红霉素的方法，该方法周期长，操作繁琐，影响因素较多，精密度低。紫外分光 光度法是比较经典的方法，但灵敏度不高，专属性差，不适于成分复杂样品的分析。薄层色谱法灵敏度高、 选择性好，但重复性差，且检测步骤繁琐。化学发光分析、二阶导数差示脉冲极谱法虽然检测灵敏度高， 但存在着仪器昂贵，设备不易普及等因素。高效液相色谱方法是g前检测红霉素药品较常用的方法，但也 仅仅局限于各种红霉素药品制剂的含量检测，而化妆品、饲料、肉类中的红霉素含量的检测还没有出台相 关的标准或方法，由丁药品组分较少，基质简单，千扰肉素较少，且样品预处理操作简便，目标检测物损 失小，因此红霉素药品的含量易于检测。与药品不同，化妆品种类繁多，基质复杂，各成分的理化性质差 别较大，干扰闵素较多，尤其是红霉素作为化妆品禁用成分添加到化妆品中，其含量较低，以上所述各种 方法很难准确的检测出化妆品中微量的红霉素成分，而且使用高效液相色谱检测化妆品中的红霉素的方法 还没有文献报道。针对以上现有技术的不足，我们设计了一种用高效液相色谱方法检测化妆品中红霉素的 方法，该方法专属性好，灵敏度高，且操作简单。

本发明的目的是提供一种检测化妆品中红霉素的分析方法，该项技术利用高效液相色谱仪不仅可以对
化妆品中的红霉素进行准确的定性分析，而且还可以进行微量的定量分析。
本发明是用无水甲醇或乙腈提取化妆品中的红霉素，经超声萃取、离心、过滤等一系列操作，滤除阔 体杂质，直至滤液澄清，取制备好的样液上机，用磷酸二氢铵一乙腈缓冲液或磷酸二氢铵一甲醇缓冲液进 行洗脱分离，在1恥-380nm波长下采集数据进行分析。所用高效液相色谱仪的主要配置包括十八烷基硅踪 键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C8柱或C18杆:，检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。
本发明方法的主要分析步骤如下
称取一定量的化妆品(乳、膏、霜或水剂)于10ml刻度离心管中，加入3—7ml无水甲醇或乙腈，涡 旋混匀使基质充分分散，定容至刻度，再超声提取15 — 30min，将提取液转移至E卯endorf管中， 12000rpm/niin离心5min，如果有必要可以再用0. 45 n m滤膜过滤备用。
(1) 色谱柱以十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂的反相色谱柱C8或C18柏-:;
(2) 检测器紫外检测器或二极管阵列检测器；
(3) 检测波长选用1恥-380nm波长作为检测波长；
合，峰形对称，分离度好(R〉1.5)。
用红霉素标准物质配制成一定梯度浓度的标准液，20nl体积进样，按外标法，以峰面积一进样浓度 作线性冋归，得出线性回归方程，利用该方程和样品中红霉素的峰面积计算样品中的红霉素含量。 4样品检测
(1) 按照1中的方法进行样品预处理，取处理好的样品20nl进样；然后再取适当浓度的红霉素标准 溶液2(^1进样。
(2) 依照2中的色谱条件进行检测，分别得到样品的色谱图和红霉素标准品的色谱图；将样品的色
谱图和标准品的色谱图进行比较，样品色谱图中与标准品保留时间相近(误差范围:标准品保留时间土0.5 分钟)的色谱峰即为相应的红霉素成分，为了确保检测结果的准确性，可对初步确定的色谱峰进行光谱分 析(光谱分析仅适用于二极管阵列检测器)，若与红霉素标准品的最大吸收波长及光谱图特征相似，可进 一步确定样品中的红霉素成分。
(3) 将样品中红霉素的色谱峰面积带入3中的线性回归方程中，计算样品中红霉素的浓度。 由于化妆品种类繁多、基质复杂，不能完全排除干扰成分与红霉素在同一时间出峰的可能。采用二极
管阵列检测器可获得红霉素的紫外吸收光谱图，与标准品的光谱图对照，通过分析二者的最大吸收波长和 光谱图特征，可进一步进行确认。
本发明的分析方法简便、快捷，灵敏度高，选择性、重复性好，适用于任何裔霜剂、乳剂、及水剂等
各种剂型的化妆品中红霉素的检测。

图2红霉素标准品色谱图
图4红霉素t示准品光谱图
下面结合具体实施实例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明 1材料 1.1仪器
乙腈(色谱纯)、无水甲醇(色谱纯)为Merck公司产品；磷酸二氢铵(分析纯)、二乙胺(分析纯) 为天津科密欧试剂厂产品；超纯水由Milli-Q system制取。
红霉素标准品购于中国生物制品检定所，批号为215。 供试样品为碧颜抑痘精华、雪肌柔肤水(不含红霉素)。
精密称取40.00mg红霉素标准品置于lOml容量瓶中，加少许无水甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度， 摇匀，配制成浓度为4mg/ml的标准液作为储备液，于4i:冰箱中存放备用。 2方法
流动相采用0. lmol/L磷酸二氢铵溶液(用二乙胺调节pH值为5. 90):乙腈=60: 40缓冲溶液作
为流动相。磷酸二氢铵溶液一乙腈缓冲体系的基线噪音比磷酸二氢铵溶液一甲醇的基线噪音
小，且在pH值为5.恥时峰性对称，分离度好。 检测波长210咖。经190-380波长扫描，红霉素在197nm处有最大吸收，考虑到200 nm接近末端吸
收,溶剂吸收较强,干扰较大，而210 ran波长处溶剂吸收相对较小，故选择210 nm作为检测波长。
称取l.OOg的化妆品(碧颜抑痘精华)于10ml刻度离心管中，加入5ml无水甲醇，涡旋混匀使基质 充分分散，再超声提取20min,将提取液转移至Eppendorf管中，12000rpm/m] n离心5min，如果存必要可 以再用0. 45 !i m滤膜过滤，制成供试样品溶液。
用无水甲醇将1.3中红霉素储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列0. 1mg/ml、 0.2rag/ml、 0.4mg/ml、 0. 6呢/ml、 0. 8rag/ral、 1. 0mg/ni1、 2. Omg/ml，取各浓度的标准溶液20nl进样.按2. 1的色谱条件进行测定， 得到各浓度的峰面积，作峰面积一浓度标准曲线，得到其线性回归方程(由高效液相色谱T.作站完成计算 工作)。
取浓度为0. 4mg/ml的红霉素标准溶液，每次进样20nl，连续进样5次，按2. 1的色谱条件进行测定， 记录峰面积，计算精密度。 2. 5稳定性
取浓度为0.4mg/ni1的红霉素标准溶液，在室温下放置，分别在0h、 5. 5h、 8h、 14h、 25h进样，每次 进样20nl，按2. 1的色谱条件进行测定，比较测定结果的稳定性。 2. 6重现性
取碧颜抑痘精华样品1. OOg，按2. 2中的方法处理样品，共做5个平行样，按2. 1的色谱条件进行测 定，计算相对标准偏差，比较重现性。 2. 7加样回收率
精密称取不含红霉素的雪肌柔肤水样品5份各1. 00克，每份加入2. 0mg/ni1的红霉素标准溶液各2ml， 按2. 2的样品预处理方法进行样品预处理，在2.1的色谱条件下进行测定，计算红霉素的回收率。 2. 8样品检测
取20nl供试液进样，利用2.1中的色谱条件进行检测，获得样品的色谱阁(图O和光谱图(图3); 再取1.3中的红霉素标准品储备液稀释至为0.60mg/ml浓度，20^1进样，问样检测条件下，得到红霉素标 准品的色谱图(图2)和光谱图(图4)。
峰面积计算相对标准偏差为2.74%，说明该方法具有良好的重现性；加标问收率试验的5份平行样品的标 准品回收量和回收率见表1,由此计算得到的相对标准偏差为1. 80% 。
由红霉素标准品的色谱图(图2)可以看出，利用2. 1中的色谱检测条件得到红霉素标准品的保留时 间为5.089min，将样品的色谱图(图l)和标准品的色谱图(图2)进行比较，可见样品色谱图中在5. 127min 处有一色谱峰与红霉素标准品色谱峰的保留时间5.089min相近，误差在土O. 5分钟范闱之内，因此可以初 步确定样品色谱图中5. 127niin处的色谱峰为红霉素，该峰面积为239. 79056mm、将样品色谱图中5. 127min 处峰的光谱图(图3)与红霉素标准品的光谱图(图4)进行对比，可以发现样品的光谱图与标准品的光 谱图的最大吸收波长及光谱图特征均相似，可进一步确定样品中保留时间为5. 127min的组分为红霉素。
将样品中红霉素的色谱峰面积239. 79056咖2代入线性回归方程中，即可得到样品处理液中红霉素的含 量(由高效液相色谱工作站完成计算工作)，经计算可得碧颜抑痘精华样品中红霉素的含量为4. 73mg/g。
该发明具有高分辨率，高灵敏度，重现性、选择性好且样品预处理方法简单的特点，适宜化妆品中红 霉素的定性、定量分析。
本发明以大量实验和理论分析，找到了一种利用高效液相色谱仪检测4t妆品中红霉素的分析方法，填 补了化妆品中红霉素液相色谱分析方面的研究空白。
1 一种化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱，以磷酸二氢铵-乙腈缓冲溶液或磷酸二氢铵-甲醇为流动相，采用190-380nm的检测波长，样品预处理采用无水甲醇或乙腈溶解样品，超声萃取，0.45μm滤膜过滤，以外标法定量计算样品中红霉素浓度。
2.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二 极管阵列检测器。
3.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂的C18柱或C8柱。
5.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在丁采用190-380nm波 长进行检测，最佳检测波长为210tim。
6.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于所用流速为0.5-1.5ml/min，柱温为20-30'C，进样体积为20^1;其中最佳流速为lml/min，最佳柱温为25。C。
7.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，.其特征在T样品预处理采用无水 甲醇或乙腈溶解萃取，超声提取15-25min， 0. 45pm滤膜过滤。
8.根据权利要求1所述的化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特征在于样品分析后根据其保 留时间和光谱图进行定性分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。
本发明是一种化妆品中红霉素的高效液相色谱检测方法，其特点在于采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C8柱或C18柱；采用紫外检测器或二极管阵列检测器在190-380nm处进行检测；以磷酸二氢铵溶液-乙腈缓冲液或磷酸二氢铵溶液-甲醇缓冲液为流动相；样品经无水甲醇或乙腈萃取，超声提取20min，再12000rpm/min离心约5min，取上清液作为供试样液，如有必要可再用0.45μm滤膜过滤备用；根据样品的保留时间和光谱图进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。该发明的优点在于分辨率、灵敏度高，重现性、选择性好，样品预处理方法简单快捷，适宜化妆品中红霉素的微量分析。
发明者郑伟东 申请人:广东省保化检测中心有限公司