生物膜的形成、检测和清除
生物膜,也称为生物污染,是附着在表面并包括在细胞外聚合物的薄膜或粘液层中的微生物细胞组合体。生物膜会导致重大卫生问题,因为细菌(包括变质和致病生物)的含量可能非常高,这些细胞会逐渐分离,并在生产。生物膜中的微生物紧密地包裹在基质中,作为清洁和消毒的障碍,因此很难去除已形成的生物膜。
生物膜几乎可以在任何有营养物质的材料上形成,但如果附着面粗糙、划伤、破裂或腐蚀,则更有可能发生。物理条件,如疏水性、表面静电充注和流体流速也会影响附着。多项研究表明,疏水性、非极性表面(如铁氟龙和其他塑料)上的微生物附着比亲水性表面(如不锈钢)更快。
有机和无机成分的薄膜会在与水流体接触的表面上迅速形成。这种膜的产生是生物膜形成的重要一步,因为它改变了表面的特性,因此通过静电和范德瓦尔斯力使微生物附着力成为可能。
各种各样的微生物都可以形成生物膜,包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母菌和真菌,但有些微生物比其他微生物更容易形成,因为它们会产生细胞外附着物菌毛或鞭毛。单个微生物物种可能形成生物膜,但更常见的是,混合菌群参与。生物膜中的细菌细胞间通过可扩散的有机信号分子相互通信调节基因表达,这种现象称为群感效应。这种细胞之间合作的方式有利于整个生物膜种群通过调节水和营养物质的供应到单个细胞和去除废物。这种合作提高了保护水平,使细胞对恶劣环境的抵抗力大大加强。
生物膜在复杂的过程中逐步形成。首先,单个细胞以不稳定和可逆的方式附着在膜上,这时,通过冲洗去除正在形成的生物膜还是相对容易的。在下一步中,细胞分泌聚合物质,使它们更牢固地结合在由细胞外多糖(EPS)、蛋白质、核酸、脂肪和水构成的多样的,立体的结构中,这种结构微生物密集成团(图 1)。这是一个不可逆转的过程,这个阶段很难通过清洁去除成型的生物膜了。最后,生物膜开始分散细胞,以便它们能够在其他地方开始形成新的生物膜。
图1 冷凝管中的生物膜形成
灭菌措施通常是针对(水生)细菌的。这些细菌进入到高纯度---因而也是没有营养的制药用水中,但仅仅只是微量。由于能力的缘故,来自源水中的低浓度营养物可能会在管道系统的内表面沉积。这些表面也会有地方给细菌安身并迅速繁殖。细菌安身和滋长另一个有利因素是管道表面的水流速较低,甚至在平流中都不存在水流。因此,没有任何机械措施的情况下,不能指望用水流来冲刷细菌。正在形成生物膜的细菌行为方式与自由态时是不同的,它会导致形成多层含有多聚糖的膜,覆盖在生物膜的表面成为保护层。
在此保护层中,细菌特性比起自由态(水性)来变成能非常能耐热、耐消毒剂和脱水反应。这就是为什么生物膜中的细菌可以在灭菌后仍存在的原因。甚至即使膜中所有细菌全部被杀死,细菌多聚糖化合物仍保留在表面,为其它细菌提供理想的营养地,这些细菌可能来自进入水系统的源水。这意味着活的和死的生物膜都显示出对药品的风险。一方面,活菌或生物膜化合物的一部分保持反复依附,因而成为系统中其它部分污染的微生物来源。另一方面,被杀灭的生物膜碎片形成内毒素污染源。
这就是为什么与生物膜做斗争对于制药行业来说一直是一个挑战。为水系统制订恰当的措施(生物膜管理),以及维持一致实施这些措施是非常重要的—例如,热存贮、蒸汽或臭氧灭菌。因此,提前到规划阶段来说,都有必要制订适当的系统设计,应对生物膜生成---例如,防止死管或可能无法排空的低点。还有,系统尽可能按设计方案运行。停机总会带来更高的微生物生长风险。一个不受控的周末就足以导致严重的细菌污染。“保持系统运行”因而成为对设计良好的水系统的最好保护。
不充分的清洗温度、清洗流量、清洗时间或清洗剂和消毒剂浓度导致清洗不足有利于生物膜的形成。清洗不足的其他原因包括腐蚀或开裂造成的表面损坏,以及不适当的卫生设计,例如,储罐上的检修孔、管道连接和搅拌器周围。通常储罐是一个关键位置。
管道、阀门和泵也可能形成生物膜,特别是在接头之间的垫片和 O 型环下。此外,焊接不佳的点容易发生生物膜堆积。
板式热交换器、蒸发器中的预热器和冷却器是生物膜积累最关键的区域,因为此类设备的某些部分的温度有利于细菌生长。热交换器中的生物膜形成可能是由于热变性有机成分的燃烧颗粒的沉积物,主要是蛋白质,或由于板的腐蚀、裂纹或孔洞。这种泄漏导致产品流入板材的水边缘,微生物可以形成生物膜,这在清洗过程中是一个死角。如果设备中的压力波动,分散的微生物可能会通过泄漏吸回产品。
滤膜也是生物膜积累的重要位置,主要是因为它们比不锈钢表面更复杂,而且它们为微生物繁殖提供了较大的表面积。灌装机和装瓶机是另一个关键领域,具有许多利基,生物膜可以开发和污染液体或半流体产品。特别易受害的部位是灌装机喷嘴和输送机。
生物膜沉积物必须通过清洗来清除。这就提出了两个至关重要的问题:如何确定生物膜沉积严重的点,以及如何监测所使用清洁程序的有效性?
一个间接和传统的程序是,对在生产线既定位置采集的样品和成品,用经典微生物方法计算活微生物的数量。这种方法既费时又是回顾性的,因为结果可能需要数天时间才能获得,这往往为时已晚,因为当时制造的产品可能已经离开了工厂。
在研究实验室中,有几种用于检测和测试生物膜的先进方法,例如显微技术、光谱和免疫学技术。然而,这些方法很复杂,需要精密的仪器和高度专业化的人员,因此这些方法不太适合在工业中实际应用。
在工业环境中,最简单的监测方法是使用人体感官进行目视检查。有机沉积物是显示为白色或黄色的。但它们并不总是用肉眼可见,在紫外线下是清晰可见的,因为有机物质的分子结构在紫外线照射下会产生荧光。此外,紫外线检测与渗透测试相连可用于识别有损的表面和未被清洁喷头冲洗的表面,即,有利于生物膜形成的点(Mortensen,2014年)。使用紫外线方法有很多优点,它价格低廉,随时可用,不需要直接接触表面,并且可快速检查大面积区域。另一个优点是,检查的结果直接在测试表面上查看,可以马上找到问题。管道中的生物膜形成可以通过内窥镜视频检测与紫外线照射相结合进行有效监测。该方法还可用于检查管道中的焊接,以找到生物膜可能聚集的位置。
可接触表面的微生物污染可通过擦拭方法(如 ATP 擦拭测试)进行评估。ATP(三磷酸腺苷)是所有生物的主要能量载体,ATP生物发光的测量是监测污染的一种广泛使用的快速方法。在便携式仪器中擦拭表面并测量探头后,结果提供了清洁度的估计。该方法易于使用,但每次分析的成本相对较高,在大面积需要检查时,擦拭测试不是特别有用。此外,ATP 测试的检测限制相对较高。还应认识到,生物膜可能粘在表面太紧,以至于擦拭只去除薄膜的一小部分。尤其是在消毒后进行擦拭,生物膜外层的微生物已经死了,而生物膜内部中仍然存在着活的菌群。
在封闭系统中,无法使用擦拭测试;淋洗水测试可替代用于验证清洁效果。淋洗水在工艺的上游添加,在下游收集。有点是可以在不拆卸设备的情况下对大型且无法进入的表面区域进行采样。淋洗水可以通过ATP生物发光或测量总有机碳(TOC)进行测试。TOC包括微生物和有机沉积物,该方法在卫生标准非常高的制药行业得到广泛应用。
从水系统中去除生物膜并非易事。防止系统形成生物膜比去除要好得多。但是,当它发生时,需要用强酸,即硝酸,其次是强碱,即氢氧化钠处理。
通过这些,与生物膜相关的无机和有机化合物被非常有效地去除,并从附着表面分离。现在整个系统都用过氧化氢等强力消毒剂进行了消毒。在水系统中使用紫外线是防止生物膜形成的有效途径。