酵母rna的提取实验中为什么第一次离心留上清，第二次离心弃上清？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-09-25 12:48 标签： 酵母rna的提取及组分鉴定分析讨论

EP管、匀浆器、移液枪、漩涡振荡器、低温高速冷冻离心机、冰袋、电泳仪、琼脂糖凝胶、超净工作台

A 玻璃匀浆器、75℅乙醇预冷 ，离心机预冷至4℃ 打开超净工作台紫外灯15分钟以上

B 用酒精擦拭台面 EP管标记

1）取一定量的纯化过的孢子悬浮液，12000rpm ，离心5min，弃上清

a 或者用匀浆仪进行匀浆处理，悬浮液不经离心，直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.，然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器，转移至1.5ml EP管中

b 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次.（离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理）

3）将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

5）每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。

6）4 ℃ 12 000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相）

7）在得到的水相溶液中加入等体积（500ul）的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃ 放置20-30min。

（植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。）

（离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。）

9）加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。加入后把管子敲一敲，尽量使RNA沉淀飘起来，每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

10）4 ℃ 12 000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。

11）室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。50度保温1小时。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺。溶解，-70℃保存。可以分装保存，防止污染，

12）取1ul+1ul buffer 电泳检测RNA完整性，稀释一定倍数，分光光度计测定纯度和浓度。

加800ul Trizol，样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。

2. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70 ℃放置一个月以上：

RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上。如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70 ℃长期保存。

预防RNase污染，应注意以下几个方面：

1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

试剂盒采用酶法破碎酵母细胞壁和碱裂解法裂解酵母细胞来提取酵母质粒DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破坏酵母细胞壁，提高酵母质粒DNA 的产量。吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地附DNA，可限度去除杂质蛋白质及细胞中其他有机化合物。使用本试剂盒提取的酵母质粒DNA可适用于各种常规的分子生物学实验，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。溶液YP1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA全部加入），混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、取1-5ml酵母培养物（不超过 5×107cells），12000rpm离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2、酵母细胞壁的破除：

B、玻璃珠法：向酵母菌体中加入 250ul 溶液 YP1（请先检查是否已加入 RNaseA） ，充分悬浮沉淀。加入 150-200ul酸洗玻璃珠（自备），漩涡振荡 10min。简短离心使玻璃珠沉降到离心管底，吸取上清（如上清有所损失，请用溶液 YP1 补足至 250ul）于另一干净离心管中。

3、向离心管中加入 250ul溶液 YP2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组 DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏。

4、向离心管中加入 350ul溶液 YP3，立即温和地上下翻转 6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心 10 min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液 YP3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

5、将上一步所得上清液加入吸附柱中，室温放置 2min，12000rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入 700ul 漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8、12000rpm 离心 2min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR 等。

1、溶液YP1在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的RNaseA 全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。

2、次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙醇配制成工作液(向15ml的漂洗液中加入60ml的无水乙醇)。

3 、使用前请先检查溶液 YP2 和溶液YP3 是否出现混浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。

5 、质粒得率与酵母菌株、质粒拷贝数、培养条件等因素有关。通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或分光光度计法都很难检测到，可通过PCR 或转化大肠杆菌来检测。

6 、DNA浓度及纯度检测：得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有***吸收峰， OD260值为1 相当于大约50  μg/ml 双链DNA、40 μ g/ml 单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9 ，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

PH0203 革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒

PH0204 革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒

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