1、转录在poly A的位置上终止

2、转录的原料是dNTP

3、增强子发挥作用与方向性无关，但有组织特异性。

4、模板并非总在同一单链上,某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。

5、一个操纵子只含一个启动序列及数个可转录的编码基因。

1、细胞中大多数天然蛋白质折叠都是自动完成的

2、当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止

3、多个核糖体聚集在一起即为多核糖体

4、肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环

5、蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。

5、当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止

6、蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。

7、多个核糖体聚集在一起即为多核糖体

7、性激素受体位于细胞核。

7、蛋白质被水解断裂的键是氢键。

1、蛋白质被水解断裂的键是氢键。

8、性激素受体位于细胞核。

15、多个核糖体聚集在一起即为多核糖体

16、蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。

17、当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止

25、蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。

26、肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环

27、多个核糖体聚集在一起即为多核糖体

28、当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止

29、细胞中大多数天然蛋白质折叠都是自动完成的

33、一个操纵子只含一个启动序列及数个可转录的编码基因。

34、模板并非总在同一单链上,某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。

35、增强子发挥作用与方向性无关，但有组织特异性。

36、转录的原料是dNTP

37、转录在poly A的位置上终止

1、蛋白质被水解断裂的键是氢键。

8、性激素受体位于细胞核。

15、多个核糖体聚集在一起即为多核糖体

16、蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。

17、当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止

25、蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。

26、肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环

27、多个核糖体聚集在一起即为多核糖体

28、当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止

29、细胞中大多数天然蛋白质折叠都是自动完成的

33、一个操纵子只含一个启动序列及数个可转录的编码基因。

34、模板并非总在同一单链上,某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。

35、增强子发挥作用与方向性无关，但有组织特异性。

36、转录的原料是dNTP

37、转录在poly A的位置上终止

cas12a的新型冠状病毒orf1ab基因检测方法
1.本发明涉及一种病毒核酸的检测方法，属于微生物检测应用领域。

19)，患者出现发热、咳嗽、胸闷、乏 力等流感样症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新 型冠状肺炎的传染源为新冠病毒感染者，通过呼吸道飞沫，直接接触新冠病毒 污染物，粪口途径等多种途径在人群中迅速传播，所有人群均易感。目前，新 型冠状病毒的检测和确诊方法有：核酸检测法、免疫学检测方法和病毒分离培 养，其中核酸检测是认可度最高的检测方法。
crispr associated gene)全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”， 该系统首先在大肠杆菌中被发现。随着对crispr
cas系统作用机制和cas蛋 白功能的逐步揭示，研究人员发现该系统具有强大和广泛的应用潜力，如：作 为基因编辑工具，调节基因表达，用于核酸检测和诊断，核酸成像技术，对细 菌进行快速分子分型等。新发现的cas12a系统可用于核酸检测，实现病原体 的快速诊断。crispr
cas12a系统用于核酸检测的原理为：cas12a蛋白首先 与相应的crrna结合形成cas12a
adjacent motif，pam)，crrna与dna双链中 的目标链互补结合形成r环，dna双链解螺旋，ruvc核酸内切酶催化位点 构象激活，由于该核酸内切酶位点每次只能嵌入一条dna链，因此目标dna 双链依次断裂，首先剪切非目标链，随后剪切目标链。切割产物从复合上释放 出去后，cas12a蛋白的ruvc核酸内切酶催化位点保持激活状态，可随机剪切 降解任意单链dna。基于该原理，将单链dna制备成荧光淬灭探针，通过监 测荧光信号的释放实现对目的序列的特异性检测。然而，使用单一的 crispr
cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术 联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。
5.本发明的目的是基于crispr
检测方法，建立一种可以快速检测新型冠状病毒的高灵敏、高特 异的核酸检测方法。

6.基于上述目的，本发明首先提供了一种用于crispr
7.其次，本发明还提供了一种应用上述crrna分子基于非诊断目的的 crispr
2核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
8.(1)制备样本核酸模板；
9.(2)使步骤(1)获取的核酸模板，cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基 团双标记的dna探针，以及所述crrna分子在crispr
cas12a反应体系里 反应；
10.(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。
11.在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述的样本核酸模板由重组酶聚合 酶核酸扩增方法制备。
12.在一个更为优选的实施方案中，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物选 自含有seq id no.10
14任一所示序列的核酸，所述重组酶聚合酶核酸扩增的 下游引物选自含有seq id no.15
19任一所示序列的核酸。
13.尤为优选地，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由seq id no. 14所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由seq id no.17所示。
14.在另一个优选的实施方案中，步骤(2)所述crrna分子的序列如seq idno.7所示。
15.在又一个优选的实施方案中，步骤(2)所述dna探针的序列如seq idno.9所示。
16.第三，本发明还提供了一种crispr
cas12a技术检测试剂盒，所述试剂 盒包括权利要求1所述的crrna分子，cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基 团双标记的dna探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有seq idno.10
14任一所示序列的上游引物，用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有seqid no.15
19任一所示序列的下游引物。
17.在一个优选的实施方案中，所述crrna分子的序列如seq id no.7所示， 所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由seq id no.14所示，所述重 组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由seq id no.17所示。
18.在另一个优选的实施方案中，所述dna探针的序列如seq id no.9所示。
20.在一个优选的实施方案中，所述下游dna单链的序列为seq id no.8所 示。
21.第五，本发明提供了一种用于制备上述crrna的方法，所述方法为，先 使序列如seq id no.20所示的上游dna单链和序列如seq id no.2、seq idno.4、seq id no.6、seq id no.8中任一所示的下游dna单链进行杂交制 备dna体外转录模板，再根据所述dna体外转录模板转录制备所述crrna。
22.在一个优选的实施方案中，所述下游dna单链的序列为seq id no.8所 示。
23.最后，本发明提供了一种用于评价上述试剂盒灵敏度和/或特异性的质粒， 所述
质粒是在序列如seqidno.21所示的puc57质粒的402bp至424bp区间插入序列如seqidno.22所示的核酸构建而成。在本发明的一个具体实施方案中，所述puc57质粒的402bp至424bp区间被序列如seqidno.22所示的核酸所替换。
2的orf1ab基因的方法简便易行快速，针对样本核酸一步即可完成检测，仅需30
60分钟，便于基层的快速检测。当结合重组酶聚合酶核酸扩增(recombinase
cas12a检测技术的灵敏度高，至少可达到1000copies/ml。在对新冠病毒样本核酸的orf1ab基因进行检测的实际应用中，该检测方法的检测灵敏度为96.00％，特异度为100.00％，阳性预测值为100.00％，阴性预测值为96.15％，可有效检测新冠病毒核酸样本,与荧光定量pcr法一致性较高。本方法仅需要提供37℃
42℃即可完成全部反应，通过简单的荧光读取设备即可判读结果，适合仪器条件较为简单的卫生机构或疫情现场开展使用。
cas12a核酸检测靶点基因序列比对结果图；
27.图3.含目的基因序列的puc57质粒图谱；
28.图4.orf1ab基因检测靶点筛选结果图；
4恒温扩增引物筛选电泳图；
4检测靶点特异性结果图；
4靶点的检测下限结果图。
32.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
cas12a蛋白(北京科昕生物科技有限公司)、rt
ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)(上海伯杰医疗科技有限公司)
cas12a的新型冠状病毒核酸检测方法的建立
37.1.1新型冠状病毒基因序列分析寻找新型冠状病毒crispr
38.方法：从ncbi数据库中下载506条新型冠状病毒基因序列，使用mafft 软件进行基因序列比对，参数设置为自动，得到新冠病毒的保守基因序列。同 时，从ncbi数据库中下载其它六种可感染人的冠状病毒的基因序列，包括 hcov
cov，将这些冠状病毒的基因序列与新型冠状病毒的基因序列再次进行 比对，得到新型冠状病毒的特异性保守基因序列。
cas12a系统的核酸检测目的基因序列5’端pam序列为tttn。 在序列比对得到的新冠病毒orf1ab基因序列保守区寻找crispr
cas12a系统 的核酸检测靶点。
40.结果：506条新型冠状病毒基因序列经过比较后，共找到4个orf1ab基 因的crispr
cas12a核酸检测靶点，见表1，与其它六种可感染人的冠状病毒 基因序列无交叉，4个检测靶点的基因序列均有良好的特异性，见图1。图1 中：a：orf1ab
注：检测靶点的位置以nc 045512基因序列为参照。
1.2设计合成各检测靶点的crrna
方法：根据各靶点的基因序列以及crispr
cas12核酸检测系统，设计相 应的crrna。crrna序列由两部分构成：5’端的保守基因序列(scaffold/repeat 部分)，以及3’端的靶基因序列的互补序列构成。crrna序列可由生物公司直 接合成，或通过t7体外转录的方式获得。本发明主要通过t7体外转录的方 式得到各核酸检测靶点的crrna，下文将对该过程进行详细介绍。
cas12a系统中，依据双链dna中目标基因序列的互补基因序 列，在其5’端插入crispr
cas12a核酸检测系统的保守基因序列，即可得到 该检测靶点的crrna序列。在该crrna序列的5’端插入t7启动子基因序列： taatacgactcactataggg(seq id no.20)，将该基因序列反向互补后即可得到该检 测靶点的t7体外转录单链dna模板，如图2所示。图2中，crrna序列中 划线部分为crispr
cas12a核酸检测系统的保守基因序列，体外转录模板序 列中划线的部分为t7启动子的反向互补序列。
使用退火的方法生成t7体外转录双链dna时，需要上游dna单链和下 游dna单链，其中上游(t7
reverse) 为各核酸检测靶点的t7体外转录单链dna模板序列，按照表2所示方案配 置退火反应体系。将该反应体系置于pcr仪、水浴
锅或恒温金属浴中，95℃孵育10分钟，关闭仪器电源，仪器温度自然降至室温后取出；或将该反应体系放入pcr仪中95℃孵育10分钟后，以0.1℃/s的速率降温至4℃后取出，退火产物于
将各核酸检测靶点的退火产物作为样本dna，使用t7体外转录试剂盒(hiscribet7快速高效rna合成试剂盒，neb)进行体外转录，体外转录反应体系如表3所示。将配置好的转录体系混匀并短暂离心后，置于37℃恒温培养箱或恒温金属浴中过夜孵育(12
表3.退火体外转录反应体系
将过夜孵育的样本取出，向反应管中依次加入20μl无酶水和2μldnasei，以去除残留的dna核酸，混匀并短暂离心后置于37℃恒温培养箱或恒温金属浴中孵育15分钟后取出。
使用monarchrna纯化回收试剂盒，按照说明书对crrna进行纯化回收，具体步骤如下：
b)添加150μl无水乙醇至样本中并吹打混匀，将吸附柱放入收集管中，添加样品反应液至吸附柱中，静置几分钟后13000r离心1分钟，弃废液；
c)将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μlrnacleanupwashbuffer，13000r离心1分钟，弃废液，该步骤重复两次；洗液第一次使用时应根据说明加入相应体积的无水乙醇；
d)将吸附柱转移至1.5ml无酶管中，加入20
30μl无酶水至吸附膜，对 纯化的样本crrna进行洗脱，室温下静置10分钟后13000r离心1分钟，收 集离心液；使用超微量分光光度计测量crrna浓度，于
所有的t7体外转录单链dna模板序列，以及t7启动子基因序列均由北 京天一辉远生物科技有限公司合成。
cas12a系统核酸检测的原理，以及其crrna的保守 基因序列，设计得到4个n基因的crrna和crrna t7体外转录单链dna序 列，通过直接合成或t7体外转录的方式得到检测靶点的crrna。具体基因序 列详见表4。
1.3靶点阳性质粒标准品
cas12a核酸检测靶点的目的基因序列， 以及该基因序列其前后各200
300bp的核苷酸序列，插入puc57质粒骨架中 替换402至424bp区间，合成相应核酸检测靶点的阳性质粒，用于评价检测靶 点的特异性。在本发明的一个具体实施方案中，插入的核苷酸序列如seq idno.22所示，puc57质粒序列见seq id no.21。使用相同的方法，选择近似 位置的基因序列，合成其它六种可感染人的冠状病毒的orf1ab基因的阳性质 粒标准品，其中插入的sars
229e的orf1ab基因序列如 seq id no.28所示。puc57质粒的质粒图谱如图3所示，target标识处为插 入序列所在位置。所有的质粒全基因组序列均由北京天一辉远生物科技有限 公司合成。
cas12a系统的核酸检测
1.4.1合成单链dna荧光报告探针
在单链dna基因序列的两端分别标记fam荧光基团和bhq1荧光淬灭 基团，即可构成单链dna荧光报告探针。报告探针的基因序列为： 5
(seq id no.9)，由北京天一辉远生物科技有限公 司合成。
cas12a系统的荧光检测
使用本发明建立的crispr
cas12a核酸检测体系对新冠病毒orf1ab基因 各检测靶点的基因扩增产物进行检测，按照表5配制荧光检测体系。将配制好 的反应液加入96孔板中，使用多功能酶标仪或荧光定量pcr仪进行荧光强度 检测，其中酶标仪设置激发光波长495nm、发射光波长520nm，荧光定量pcr 仪选择fam荧光通道。反应温度为37℃，每隔2分钟检测一次荧光值，连续 检测30
60分钟，观察各靶点crispr检测反应中荧光强度升高情况。
注：荧光定量pcr仪的反应体系总体积为25μl，表中各反应组分均减半。
1.4.3阳性结果判定
与阴性对照相比，检测60分钟时荧光强度有明显升高，经过统计学分析， 三次重复实验的荧光强度值与阴性对照间有统计学差异。
1.5.1设计各检测靶点的恒温扩增引物
raa恒温扩增引物的设计要求为：引物长度为30
35bp，引物的5’端为 at碱基富集区，引物的3’端为cg碱基富集区，避免引物自身形成发夹结构， 避免上下游引物之间形成引物二聚体，可不考虑引物本身的溶解温度tm值。 在本实施例中，设计恒温扩增引物时，在保证引物扩增效率的情况下，使扩增 产物的片段长度尽量小。
在每个crispr核酸检测目的基因处设计多条上游扩增引物和多条下游 扩增引物，配对组合后对含有各检测靶点基因序列的阳性质粒标准品进行扩增。
所有的引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
使用基础型核酸扩增试剂(raa法)对各靶点阳性质粒进行扩增，按照 表6的方案配制恒温扩增体系。将各反应溶液加入酶反应干粉管中，充分混匀 后短暂离心，将反应管置于39℃恒温金属浴或pcr仪中反应30分钟，扩增 完成后取出，扩增产物于4℃保存备用。
各引物对的核酸扩增效果可通过dna凝胶电泳检测判定。
表6.raa恒温扩增体系
注：a液为水化溶液，b液为乙酸镁。
基础型核酸扩增试剂(raa法)，对新型冠状病毒样本核酸进行 一步法反转录
恒温扩增反应，核酸扩增体系同表6。将配置好的反应溶液置于 42℃恒温金属浴或pcr仪中反应30分钟，扩增完成后取出，扩增产物于4℃ 保存备用。
核酸扩增效果可通过dna凝胶电泳检测判定，实验方法同上。
结果：相同浓度含有各检测靶点基因序列的阳性质粒为dna样本，使用 相同的crispr
cas12a核酸检测体系，检测体系中保持各靶点crrna浓度一 致，相同的反应时间和条件下，对orf1ab基因的4个核酸检测靶点进行 crispr荧光检测。四个检测靶点的荧光值与阴性对照相比均有统计学差异， 选择荧光值最高的orf1ab
cas12a系统的核酸检测靶点，并进一步评价该靶点的检测特异性和检 测下限。检测结果如图4所示，4个检测靶点的荧光值与阴性对照相比均有统 计学差异，p＜0.0001，选荧光值最高的检测靶点orf1ab
cas12a核酸检测靶点，进一步评价该靶点的特异性和检测下限。图4 中，4个核酸检测靶点crispr荧光检测时，60分钟内各靶点荧光值变化折线 图；b：4个核酸检测靶点荧光检测60分钟时的荧光强度值；各组荧光值与阴 性对照组比较，****为p＜0.0001。nc为阴性对照。
4检测靶点恒温扩增引物的设计和筛选
4检测靶点共设计合成了5条上游引物，5条下游引物， 各引物基因序列信息见表7。将上下游引物两两配对组合，恒温扩增该靶点基 因的阳性质粒，各引物对核酸扩增情况如图5所示。对于扩增效果近似的引物 对，对其扩增产物进行crispr
cas12a核酸检测，最终选取核酸扩增片段较 短的引物对orf1ab
4靶点的恒温扩增体 系。图5中，1
5r依次配对。23泳道为最终选择引物对扩增结果。
4检测靶点恒温扩增引物
结果：使用筛选得到的orf1ab
4检测靶点的扩增引物，对其它六种冠状 病毒的orf1ab基因阳性质粒进行raa恒温扩增，随后进行crispr
cas12a 检测，观测荧光值升高情况。检测结果如图6所示：orf1ab
4靶点的特异性 较好，检测60分钟时，除新冠病毒orf1ab基因阳性质粒荧光值升高外，其 它冠状病毒的荧光值均无升高。因此，最终选择orf1ab
cas12a核酸检测靶点，并进一步评价其检测下限。图 6中nc为阴性对照。
4靶点的阳性质粒作为标准品，用于评价各靶点 raa
crispr荧光检测的灵敏度/检测下限。使用超微量分光光度计测量阳性 质粒的浓度，根据质粒浓度和质粒片段大小计算质粒拷贝数。对质粒浓度进行 十倍梯度稀释，直至稀释到单拷贝每微升为止。
注：c为质粒浓度，dna length为阳性质粒的基因序列全长，x为最终得 到的质粒拷贝数。
结果：使用筛选得到的orf1ab
4靶点的扩增引物对，raa恒温扩增梯度 稀释的各浓度新冠病毒orf1ab
4靶点阳性质粒，并对扩增产物进行 crispr
4靶点的检测下 限即可达到1000拷贝/ml，crispr检测荧光值与阴
性对照相比p＜0.05，其 它浓度阳性质粒样本的荧光值与阴性对照相比p值均小于0.0001。图7中，a： orf1ab
4检测靶点crispr荧光检测时，30分钟内各浓度样本荧光值变化折 线图；b：各浓度样本orf1ab
4靶点检测30分钟的荧光强度值，各组荧光值 与阴性对照组比较，*为p＜0.05。nc为阴性对照。
因此，本发明建立的基于crispr
4检测靶点的crispr荧光检测，对新冠病毒orf1ab基因的检 测灵敏度高，至少可达到1000copies/ml。
应用实施例新型冠状病毒核酸样本检测
方法：使用上述建立的新冠病毒orf1ab基因的核酸检测平台，对经过核 酸检测金标准“荧光定量pcr法”确认的新冠病毒核酸样本进行检测，验证各 靶点rt
crispr荧光检测对实际核酸样本的检出情况。
pcr方法：使用上海伯杰医疗科技有限公司的新型冠状病毒 2019
ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)，对新型冠状病毒样本核酸进行检 测与鉴定。按照说明书配制反应体系，使用bio
rad cfx96荧光定量pcr仪 对样本核酸进行检测，按照说明书设置反应条件，选择fam，hex，rox荧 光通道，根据各荧光通道的ct值判定新冠病毒核酸样本的检测结果。
结果：收集了25份新型冠状病毒阳性临床核酸样本，25份阴性样本，阴 性样本来自无症状一般人群，经荧光定量rt
pcr实验验证后，所有核酸样本 的完整性较好。使用本发明建立的，rt
cas12a 系统，对新冠病毒样本核酸的orf1ab基因进行检测。新冠病毒核酸样本的 orf1ab
4靶点核酸检测结果如表8所示，阳性样本检出24个，阴性样本全部 检出，该检测方法的检测灵敏度为96.00％，特异度为100.00％，阳性预测值 为100.00％，阴性预测值为96.15％，可有效检测新冠病毒核酸样本,与荧光定 量pcr法一致性较高。
表8.样本荧光定量rt