稳定哺乳动物细胞的方法
/philippspahn/imageprocessing)上获得的定制matlab脚本(mathworks)来分析原始图像。简言之，通过分割dapi通道来鉴定单独的核，并在接触或重叠核的情况下进行手动调整。对于每个核，将总γh2ax强度进行整合并相对于核大小进行标准化。选择强度整合而不是焦距列举(foci mfish探针试剂盒，metasystems)标记，用于光谱核型分析。对于核型分析，将样本中最大量的核型定义为代表性(“主要”)核型，且将与该核型的变异评分为数目改变(全染色体非整倍体)和/或结构改变(染色体间重排，可见缺失)。将结构异常的核型(图8b)定义为显示与代表性核型有至少一个结构变异的核型。
将细胞在6孔板上一式三份培养。在研究开始时(p0
dna修复基因的snp校正导致dna损伤应答改善
通过基因组编辑，我们产生了一个成功回复atm中r2830h的克隆cho-k1群体(以下称为cho atm+)。此外，从这个群体我们产生了一个成功回复prkdc中d1641n的亚克隆(以下称为cho atm+prkdc+)(图5a)。这些回复在相同的细胞系中连续进行，以评估dna修复改善的累积效应。新细胞系atm+和atm+prkdc+的全转录组测序显示仅数个差异表达基因，且基因集富集分析未鉴定出显著上调/下调的途径，这与这些snp回复对活力或代谢没有不利影响相一致。
为了评估atm+和atm+prkdc+细胞系中dsb修复能力的改善，我们实施了基于gfp的报告系统(基于ej5-gfp报告子[60])，该系统允许通过瞬时质粒转染和随后的流式细胞术来定量dsb修复。该报告子是包含一个gfp阅读框的基因表达盒，所述gfp阅读框与组成型启动子被一个大的(2kb)间隔子分隔开(图5b)。通过用表达靶向间隔子5'和3'末端的两个sgrna的cas9:mirfp质粒瞬时转染，产生两个dsb，其不恰当修复导致阳性gfp信号，这提供了对dsb修复能力的快速定量读取(图5b)。使用ku-60019(一种针对atm的高效小分子抑制剂)在cho-k1野生型细胞中验证了该测定。用这种抑制剂孵育细胞导致gfp+阳性细胞显著增加，这表明dsb修复受损(图5c)。由于atm的抑制进一步加剧了携带atm r2830h snp的细胞中的dna修复缺陷表型，因此这种突变在cho-k1中可能仅导致亚效等位基因，而不是完全丢失功能。
在新的修复优化的细胞系cho atm+上运行该测定显示出gfp信号显著降低，这表明成功改善了对所诱导损害的修复(图6a)。在atm+prkdc+中甚至可以看到进一步的改善(图6a)。这表明在这些细胞系中成功增强了dsb修复，并支持通过连续回复在cho中携带突变的dna修复基因可以实现dna修复能力的逐渐回复的观点。
为了排除可能特异于所述gfp报告子的作用，我们通过针对γh2ax(明确确定的
dsb细胞标志物)进行免疫染色，更整体地分析了dsb修复效率。γh2ax表示dsb周围染色质区域中的磷酸化组蛋白h2ax，其通常从断裂位点延伸数兆碱基，在共聚焦显微镜中作为焦点可见[61,62]。因此，γh2ax焦点的定量通常用作未修复dsb的读数，因为h2ax仅在修复已开始后才会被去磷酸化[63]。在cho-k1中，即使不存在任何产生dsb的处理，也可见低水平的γh2ax焦点，这对应于dsb的内源性起源(图6b)。值得注意的是，γh2ax的产生部分依赖于atm激酶[64]，这可能解释了为什么在未经处理的条件下，焦点强度在dna修复优化的cho系(其携带回复的atm基因并因此可能更有效地标记损伤位点)中略高。然而，在强烈的dsb诱导处理后，atm回复会因为断裂得到更有效的修复而使焦点随着时间减少。事实上，在将细胞暴露于1gy的x射线辐射后，与野生型细胞相比，在工程化细胞系中焦点强度首先更快地增加(这与改善的损伤感知相一致)，但在6小时的恢复期内可见更快地下降(图6b)。使用较低剂量的辐射，仅在2小时恢复期后即可见焦点强度的更快下降(图6b)。这些观察结果证实，dsb修复机制在工程化细胞系中更加活跃，并显示出对普遍存在的dna损伤的应答改善，而不是特异于特定位点触发的断裂。
dna修复的恢复改善了cho-k1中的基因组稳定性
dsb在细胞培养物中天然发生于内源性代谢过程或dna复制期间。如果没有正确修复，则通过p53的信号级联会使细胞周期阻滞，直到损伤得到修复[56]。在本研究分析的所有cho细胞系中，p53与其他关键细胞周期调节物携带了可能有害的snp。因此，细胞周期控制可能功能失调，这意味着尽管持续存在dsb但细胞分裂仍在继续，这可导致染色体畸变，并最终驱使转基因丢失。因此，我们想知道工程化cho细胞系中dna损伤应答的改善是否会改善基因组完整性的整体状态。为此，我们首先将野生型和工程化细胞系暴露于dsb诱导条件下，并通过电泳在单细胞水平上分析基因组完整性，电泳中所得dna尾的长度和强度两者是基因组片段化的量的指标(彗星测定)。在将细胞暴露于0.5gy辐射后，在随后的2小时复原期，我们注意到野生型cho细胞中的dna尾较长，其中一些细胞表现出非常长且大的dna尾，这表明由于持续存在的dsb而导致严重的基因组片段化。atm的恢复确实对dna尾长产生了微小变化，但prkdc的额外恢复导致尾长和强度两者的强烈降低，并且我们没有在这些样本中检测到长且大的dna尾(图7a)。当将细胞暴露于高剂量的产生dsb的药物博莱霉素时，获得了类似的结果(图7b)。总之，这些结果表明，两个dna修复基因的恢复能够显著增强dna修复并明显减少基因组片段化。重要的是，即使在不存在基因毒性应激的情况下，我们在野生型cho细胞系中也观察到了一定程度的基因组片段化(尽管程度总体上低于处理情况下)，这在我们的工程化细胞系中得到了显著改善(图7)。这表明修复优化不仅改善了人工dsb诱导后的基因组完整性，还改善了标准培养条件下的基因组完整性。
如上所述，由于未修复的dsb会导致染色体畸变，我们制备了野生型和工程化细胞系的核型样本，以在单细胞水平上分析染色体畸变。为此，将atm+和atm+prkdc+细胞系两者与亲本野生型克隆平行培养共60代(约120次倍增)，之后将细胞阻滞在有丝分裂中，制备中期染色体涂片并用染色体特异性探针染色(“染色体绘画”)来检测结构和数目变化[65]。先前证明cho核型显示显著变异，而无论培养补充或甚至克隆状态如何。我们还注意到核型中有相当大的染色体畸变，例如重大易位(major translocation)，例如在#3、#6或#7染色体上，以及完整染色体复制，例如#4，和x染色体的丢失(图8a)。当我们跨细胞系比较核型时，我们注意到两种工程化细胞系中的结构畸变显著减少(显示为易位和缺失的发生率显著降
低)(图8b)，这与改善的dsb修复和减少的基因组片段化相一致。在永久补充atm抑制剂ku-60019的情况下培养的野生型样本用作阴性对照，并显示出结构异常的大量增加(图8b)。在我们的细胞系中未见到主要稳定化(每个核型的染色体数目)(图8b)，这与atm和prkdc在染色体分离中没有直接作用相一致。我们的数据集显示了参与染色体分离的基因中的数个可能有害的snp，其将是未来研究染色体数目稳定性的有趣的目标。
总之，我们的数据表明，尽管cho细胞在dna修复基因方面承担重担，但仅恢复数个关键基因就可导致可测量的dsb修复改善、基因组片段化减少和结构染色体稳定性改善。
基因组不稳定性通常会破坏生物制造工业中高蛋白滴度的维持。基因组稳定化可以通过减缓由染色体不稳定引起的转基因拷贝丢失来解决这个问题。在上述cho-k1细胞系中获得的结果支持了对dna修复基因的工程化可以帮助实现这一目标的观点。由于cho-k1不表达任何转基因，我们试图在cho-seap中应用这种策略，所述cho-seap是表达人分泌碱性磷酸酶(seap)的贴壁细胞系[66]。为了从我们的snp分析中探求其他基因靶点，我们选择了xrcc6，所述是xrcc6是nhej修复途径的另一个关键组成部分，它在我们数据集中的所有11个cho系中均携带可能有害的q606h snp。我们通过慢病毒整合来表达中国仓鼠野生型拷贝的xrcc6，生成了dna修复优化的cho-seap细胞系。新细胞系cho-seap cmv::xrcc6显示在ej5-gfp测定中与cho-seap野生型相比不成功的修复事件减少了超过50％，这证明dsb修复显著改善(图9a)。令人惊讶的是，atm和prkdc中各自的r2830h和d1641n snp回复并没有对该细胞系产生进一步的改善，而是导致dsb修复能力的下降(图9a)，这与我们在cho-k1中观察到的相反。与这一观察结果相一致的是，atm的化学抑制导致修复能力的改善(图9a)，这与我们在cho-k1中的观察结果相反(见讨论)。
为了最终研究dna修复优化是否对转基因表达有有益效果，我们在长期培养实验中同时培养cho-seap wt和cho-seap cmv::xrcc6，并在开始和结束时比较了seap滴度。在实验开始之前，将细胞在5um甲氨蝶呤(mtx)中培养1周以选择高seap表达，然后对一半样本从生长培养基中去除mtx(图9c)。mtx是二氢叶酸还原酶(一种必需的代谢酶)的竞争性抑制剂，其与转基因seap基因座共表达(图9b)。尽管在恒定mtx补充下生长的对照细胞没有显示出seap滴度降低，但在实验结束时，在没有mtx的情况下生长的野生型细胞显示出seap滴度显著损失。有趣的是，cmv::xrcc6过表达足以避免这种滴度损失，达到与在野生型细胞系中补充mtx相当的水平(图9d)。这些结果表明，dna修复优化可以导致cho生产细胞系中的滴度稳定化。
长期以来，错误的dna修复一直被认为是基因组不稳定性的主要驱动因素[67-69]。除了少数先前研究鉴定了受损修复途径[70,71]外，这是第一份记录影响多种cho细胞系中dna修复基因的突变损伤的完整延展报告。此外，尽管之前已经成功实施了对沉默的dna修复基因的重新激活[72]，但尚未系统地探索dna修复能力的恢复作为在细胞系发育背景下减轻基因组不稳定性的手段。这项研究是第一份表明通过基因组编辑恢复dna修复功能可以改善cho中基因组稳定性的报告。更重要的是，我们表明，尽管dna修复基因中的突变负担高，但仅单个基因的恢复就可以在基因组完整性方面产生可测量的改善。这使得dna修复的恢复成为细胞系工程化工具箱中一个强力且可行的新增成员。我们的受影响dna修复基因的数据集为未来的研究开辟了多种选择，以单个基因或基因的组合为目标，开发用于
生物制药产业的具有改善的稳定性和生产力属性的新细胞系。尽管最近已描述了有效的替代方法来提高cho细胞中的生产力，例如关键代谢基因的过表达[73]、细胞凋亡的抑制[74]或新启动子的设计[75]，但dna修复的恢复解决了基因组不稳定的根本机制原因，并因此可以实现持久的稳定性改善。除了蛋白表达之外，dna修复基因的恢复将可能在细胞系工程化的其他方面被证明是有效的，例如在改善cho中靶向基因整合或基因校正率的背景下[76]。此外，所述方法很可能扩展到其他哺乳动物细胞系。
如本报告所示，当dna修复基因的组合正在被恢复时，dsb修复能力的改善似乎以递增方式发生，前提是这些基因协同起作用。因此，寻找这样的协同组合是一个主要挑战。尽管关于人类癌症、dna修复或进化保守性[77]的文献数据对于手工挑选可能有效的候选基因非常有用，但我们从cho-seap的atm恢复和抑制中获得的出乎意料的结果是一个警示信号。鉴于不同cho细胞系的不同基因组以及哺乳动物dsb修复级联的复杂的相互交织的性质[78]，来自一个细胞系的结果可能不一定同样适用于其他细胞系。在哺乳动物中，dsb修复遵循“决策树”[78]，其中途径选择很大程度上取决于dna损害的严重程度。具体地，尽管核心nhej途径可以独立于atm起作用[78,79]，但atm在启动需要更多预处理和更高级的修复途径(例如同源介导的修复(hdr)、替代末端连接(aej)或fanconi贫血(fa)途径)的损害修复中起关键作用[78,80]。为了使其有效，atm下游的这些通路中的基因需要具有功能，因此在cho-k1中，这些通路可能保留了比在cho-seap中更高的功能性。事实上，我们的数据集显示，与cho-k1相比，cho-seap(dxb11衍生物)中的hdr或fa途径中snp的发生率更高(图1)。因此，在cho-seap中，atm恢复可能引发了负面的净效应，下游通路在很大程度上丢失了能力，尤其是因为途径间的竞争[81]可导致功能性nhej的抑制。先前的研究报告了对关键dna修复基因(例如atm或mre11)的抑制类似的出乎意料的影响[76,82]。因此，在恢复相同基因后观察不同cho细胞中的相反效应，为研究dsb修复层级内的协同基因关系和竞争提供了一个有前景的模型平台。
与atm恢复不同，xrcc6的恢复导致了dsb修复的显著改善(如ej5-gfp测定所示)，尽管xrcc6中的snp仅是杂合的。然而，ku70(由xrcc6编码的蛋白)必须与ku80结合以形成异二聚体ku复合物，并且因此xrcc6中的突变更有可能发挥显性表型。事实上，在人类细胞中，杂合的ku80突变足以引发基因组不稳定性的增加[83]。
因此，重要的是要注意，需要仔细考虑靶标选择，并且尽管来自文献的数据、杂合性状态或表型预测可以作为有用的指导，但强烈建议进行预先测试或甚至筛选候选基因。本研究中描述的ej5-gfp细胞系可作为用于此目的的优秀研发工具。当然，由于假阳性信号(即，尽管存在cas9:mirfp也不会被切割的报告位点，或其丢失末端未能完全融合的报告位点)的可能性，该测定是近似的，但它仍然提供了对dsb修复能力的良好预估，因为阳性gfp表达仅在不完美的dsb修复处理后发生。此外，我们使用补充的dsb修复评估方法验证了该测定。因此，这种内置的gfp报告系统是一种有用的技术，其甚至可以快速且有效地筛选众多候选基因。
总而言之，这项研究首次剖析了cho细胞中基因组不稳定性的遗传基础，并构建了概念验证证明dna修复工程化作为一种用于在工业化蛋白表达中细胞系开发的强有力的新方法并可能不止于此。

上海翊霈工业控制设备有限公司

翊霈优势供应德国及欧、美、日工控产品及仪器仪表
询价请提供品牌、型号及数量，部分产品需提供铭牌照片

专业采购德国工控产品、源头供应欧美日工控备件
    2、厂家询价报价，享受德国本国企业的价格折扣，价格在国内市场上更具优势！

    3、德国公司集中从相应品牌厂家采购，每周日从德国总部发货！

    4、产品可修或换，由我司会负责跟厂家沟通，提供维修检测服务
    5、只要是德国及欧盟国家的产品，我们可以为您询价并采购！

上海翊霈工业控制设备有限公司WEIGEL代理，快速提供WEIGEL价格和WEIGEL货期，从德国WEIGEL厂家直接拿货，有基本所有WEIGEL型号，并且部分型号有WEIGEL现货。，而且我们提供WEIGEL OEM定制服务，您把模拟量仪表的参数告知，就会有相应的产品出来。包您满意！

具体产品型号详情如下：