液液萃取寡核苷酸时必须有苯酚吗？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-10-05 15:09 标签： 苯酚的分离和提纯

【问题1】大肠杆菌能生产糖蛋白吗？

【解答】干扰素有两种类型,一种是天然干扰素；另一种是重组干扰素,是通过基因工程技术生产的。研究表明，以基因工程和发酵工程为手段,用大肠杆菌生产出来的干扰素是没有糖链的,化学本质虽不是糖蛋白,但同样能够抑制病毒在细胞内的增殖,增强T、B淋巴细胞的功能,加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用,也是干扰素。

真核细胞给蛋白加上糖链后,能够帮助蛋白折叠成正确的构像, 同时糖链有助于蛋白质的溶解,防止蛋白聚集沉淀,从而能使糖蛋白分泌到细胞外。而在大肠杆菌表达的非糖基化蛋白常常会聚集成不溶性的包涵体。一方面,包涵体中的蛋白是没有生物活性的,需要通过后续的溶解、纯化、复性等使其变成有生物活性的蛋白[1]；另一方面,一些糖蛋白在去除糖链后尽管仍具有一定的生物活性,但是易被蛋白酶降解。因此,真核细胞表达的干扰素需要糖链来稳定结构、帮助溶解, 并通过转运系统分泌到细胞外,以达到抗病毒、抗肿瘤的功效。

目前科学家发现某细菌里存在生产糖蛋白的基因簇,科学家用基因工程方法将这套基因簇克隆至大肠杆菌内进行表达,使得大肠杆菌也能够生产出相应的糖蛋白[2]。

【问题2】蛋白质的分离纯化有哪些方法？

【解答】蛋白质的分离方法除了教材介绍的凝胶色谱法之外，还有以下几种方法：

1、粗提取方法有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法[1]；

2、离心法有差速离心法、密度梯度离心法[1]；

3、精提取方法有离子交换层析、疏水相互作用层析、置换层析、亲和层析、高效液相色谱、聚丙烯酞胺电泳、等电聚焦电泳[2]、毛细管电泳；

4、此外，还有双水相萃取技术、浊点萃取法、反胶团萃取等方法[1]。

迄今为止，我国还没有研究单一的蛋白质分离方式，不能利用合理的措施提升其纯度与分离效果。还需要利用物理与化学方式对其分离处理，在多种方法联合的情况下，确保蛋白质的分离纯化符合规定。

[1]张向阳主编. 医学分子生物学[M]. 南京，江苏凤凰科学技术出版社,

【问题3】动物细胞培养的代数是细胞分裂次数吗

【解答】原代培养是指从机体组织分离后立即在体外进行首次培养，使其在合适的条件下增殖到第一次传代阶段的培养阶段。这样培养的细胞称为原代细胞。原代细胞与机体组织在形态结构和功能上很相似，细胞移动活跃，细胞分裂不旺盛[1]。

传代培养是指当培养容器内培养的体外动物细胞增殖达到一定密度后，因为生存空间和营养有限，细胞会停止分裂增殖，这时需要分离到多个容器中继续培养，使细胞继续生存增殖，进行一次分离再培养称之为传一代，这样培养的细胞称为传代细胞[2]。

综上所述，动物细胞培养的代数是指分瓶的次数，而不是分裂次数。

[1]金征宇[等]主编. 基因与纳米探针医学分子成像理论与实践[M].

[2]刘斌. 细胞培养[M]. 北京/西安:世界图书出版公司, .

【问题4】高压蒸汽灭菌前为什么要将锅内冷空气排尽？

【解答】高压蒸汽灭菌锅内蒸汽的温度不仅与压力有关，而且与蒸汽的饱和度有关。灭菌锅内冷空气未排尽时，即使蒸汽压力达到要求，气压针所指的压强不是饱和蒸汽产生的压强。相同的压强，混有空气的蒸汽其温度低于饱和蒸汽所产生的温度，温度上不到相应的高度[1]，而且还影响高压蒸汽穿透被灭菌物品的能力，因此完全排除锅内空气使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。故首先要打开进气阀门，引导外源蒸汽进人夹层，冷空气与冷凝水由夹层的阻气器排出，大约需要10min后，再打开进气阀，蒸汽即进入锅内，如此充分的时间即可排除冷空气。如何判断冷空气是否排尽，可观察排气口的气体，若排气口气体呈白色雾状；或在排气口出口处连接一橡皮管，将另一端插入冷水盆中，若管内排出气体在冷水中产生气泡，表示锅内空气尚未排尽，需要继续排气。若不产生气泡，表示锅内空气已基本排尽。当压力表显示锅内达到所需温度时，应尽量关小排气阀以防蒸汽损失，造成锅内缺水，但注意关闭不能太紧，应稍有气体排出，保持温度压力相匹配[2]。

[1]许晓风主编；周学，袁学智，夏文静，张亮，吴金龙，姜海建副主编. 大学实验室基础训练教程[M]. 南京：东南大学出版社, 2018.06:78.

[2]王芳，李滨，郭恒俊，郭兴启.高压蒸汽灭菌锅的使用[J].实验室科学,5.

【问题5】何为基因融合技术

【解答】人教版选择性必修3第92页，对基因融合技术只介绍一句话，那么该技术具体怎样融合基因，获得的蛋白质活性怎样，具有哪些实际意义呢？

基因融合技术是将不同的基因连接起来从而表达具有复合功能的融合蛋白，构建融合蛋白的基本原则是：将第一个蛋白基因的终止子删除，再接上带有终止子的第二个蛋白基因，即可实现2个基因的融合表达[1]。融合蛋白除了具有衍生因子的双重活性外，其各自的活性可能发生如下变化。

（1）一些融合蛋白的活性较各自野生型低；

（2）活性与野生型因子活性的相加作用一致；

（3）融合蛋白的活性高于衍生因子的相加活性；

（4）人工构建的新蛋白可能具有与衍生因子无关的新活性。

构建融合蛋白技术具有以下实际意义：

（1）有利于回收目的蛋白质；（2）产生新的多功能蛋白；（3）利于检查和产物定位；（4）避免产物的快速溶解；（5）外源蛋白定位在宿主的不同区段；（6）融合蛋白在体外切割提高产量稳定性；（7）研究蛋白质结构[2]。

[1]张德华.蛋白质与酶工程[M]. 合肥：合肥工业大学出版社. 2015：68

[2]刘岩等.基因融合技术及其应用[J].农业生物技术学报.-278

【问题6】基因的定点突变技术是怎样操作的

【解答】一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。而通过定点突变技术，可以对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。目前常用的基因定点突变技术有三种：

1、寡核苷酸介导的定点突变

该方法以 M13 噬菌体的单链环状DNA 为载体。首先将目的基因插入到 M13 噬菌体的正链 DNA 上，制备含有目的基因的单链 DNA。再使用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA的一部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的 DNA 分子( 如下图) ，再经表达即可获得改造后的蛋白质[1]。




该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端。由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体( 如下图) [1]。




3、PCＲ 介导的定点突变

PCＲ 介导的定点突变一般需要 4 种引物，进行 3 次 PCＲ 反应。前两次 PCＲ 反应扩增形成两条双链 DNA 片段，这两条双链 DNA 片段经过变性和退火形成具有3’凹末端的异源双链分子，在 Taq 酶的作用下，产生含有重叠序列的双链 DNA 分子，再用两个外侧引物进行第三次 PCＲ 扩增，便产生突变体DNA，然后再构建表达载体进行表达[2]。

[2]张浩．2000．定点突变技术的研究进展．免疫学杂志，2000（4）:108～110

【问题7】聚乙二醇为什么能促使植物原生质体及动物细胞融合？

【解答】聚乙二醇（PEG）是一种用于细胞融合中的优良化学促融剂。它具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体以及动物细胞的融合。具体原因如下：

一、聚乙二醇分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合，从而形成杂种细胞[1]；

二、聚乙二醇的水溶性强，在液相介质中，其分子表面的醚键带有微弱的负电荷，在Ca2+离子的参与下，可将带正电的表面蛋白或带负电荷的糖蛋白通过Ca2+桥相连，从而使细胞发生聚集、融合。在50%PEG中自由水消失，可导致细胞脱水而引起质膜结构变化和细胞融合。

PEG用于细胞融合中的优点为：通用性强，可用于动、植物和微生物各种细胞；比仙台病毒等易制备和控制；活性稳定，使用方便[2]。

[1]蒋雪薇,王军,朱双,孙英杰,朱晓芹,刘江东.斑马鱼胚胎细胞和中国仓鼠卵巢细胞远缘杂交融合条件的优化[J].氨基酸和生物资源,2016,(第3期).

[2]郭伟.聚乙二醇水溶液性质及小分子的影响[D]. 贵阳：贵州大学,2018.

【问题8】柠檬酸钠的抗凝机制是什么？

【解答】血液凝固分为三个主要阶段：第一，凝血酶原激活物形成；第二，凝血酶原激活物催化凝血酶原转变为凝血酶；第三，凝血酶催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白。这三个阶段中，都需要钙离子的参与，所以为防止血液凝固，必须除去钙离子。而柠檬酸钠中的柠檬酸根离子能和钙离子结合，可以形成比较难解离的可溶性络合物，使血液中的钙离子减少，缓解钙离子促进血液凝固的目的[1]。

【问题9】培养乳酸杆菌为什么要添加维生素？

【解答】维生素是参与生物生长发育和代谢所必需的一类微量有机物质，在物质的代谢中有重要作用。 

首先，由于乳酸杆菌缺乏一些生物代谢途径，不能合成生长必需的氨基酸、维生素等物质，营养要求十分苛刻，必需依赖生长环境提供必需氨基酸、维生素等生长因子才能获得高密度生长；其次，乳酸菌的蛋白分解能力很弱，必需依赖生长环境提供必需氨基酸、维生素等生长因子才能获得高密度细胞培养[1]；另外，在培养基中添加维生素，能促进乳酸杆菌生长，降低菌体的死亡率；在菌体生长、细胞活性、产酸，以及乳酸生物合成中需要乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶，维生素能提高这些酶的活性，至少提高50%以上；能促进糖代谢途径中与乳酸合成相关途径的通量，使乳酸产量提高40%以上[2]。

[1]白凤翎， 张柏林， 赵宏飞. 大豆蛋白水解物促酸奶乳酸菌增殖及生长动力学[J]. 食品与发酵工业,-56.

[2]邱伙琴，徐国谦，庄英萍，储炬，张嗣良. 维生素对乳酸菌细胞活性和代谢途径相关酶活性的影响[J]. 华东理工大学学报,):330-335.

【问题10】平板划线的操作只有一种方法吗？

【解答】平板划线法在实际的操作中分为两种：交叉划线法和连续划线法。

交叉划线法适用于含菌量多或含有不同细菌的培养物。操作方法见人教版选修一教材第18页；连续划线法适用于细菌数不太多的培养物，用接种环先沾取培养物，涂布于平板表面一角，然后连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180，再从平板另一边（不烧接种环）同样划至平板中央后培养，实质上属于一种“由点到线”的划法[1]。教材第14页的右图即可认为是运用的这种方法。

[1]洪坚平，谢英荷等编著.农业微生物资源的开发与利用[M].北京：中国林业出版社, 2000.08:43.

【问题11】乳酸杆菌必须无氧培养么？

【解答】厌氧菌通常是指一类只能在低氧分压的条件下生长，而不能在空气（18%氧气）和（或）10％二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的细菌。    大多数乳酸杆菌属于耐氧性厌氧菌。分子氧对它们无害，无论在有氧或无氧条件下都生长良好，好氧生长速率甚至可能高于厌氧生长速率；其产物有乳酸、乙酸和少量丙酮[1]。    在制作泡菜和酸菜的过程中就是利用乳酸菌的这一生理特点。由于乳酸杆菌生长旺盛产生大量乳酸，使环境的pH下降，从而抑制不耐酸的腐败细菌的生长。而乳酸杆菌具有高度耐酸性，它的生长不受酸抑制。在制作过程中需要密封，隔绝空气。这并不是为乳酸杆菌创造无氧的生长条件，而是为了抑制好氧腐败细菌的生长[2]。

[2]颜方贵.发酵微生物学[M].北京:中国农业大学出版社,-135

【问题12】什么是磁力搅拌器？

【解答】人教版选修一的血红蛋白的提取和分离实验中，将红细胞中血红蛋白释放出来，需要用磁力搅拌器充分搅拌10min，那么什么是磁力搅拌器呢？

磁力搅拌器是用于液体混合的实验室仪器（如下图），主要用于搅拌或同时加热搅拌低粘稠度的液体或固液混合物，无振动、搅拌效果显著。和摇床一样，可以免除长时期的手工机械操作[1]。

其基本原理是利用磁场的同性相斥、异性相吸的原理，利用磁场推动放置在容器中带磁性的搅拌子进行圆周运转，从而达到搅拌液体的目的。一般的磁力搅拌器具有搅拌和加热两个作用。搅拌使反应物混合均匀，使温度均匀；加热是在一个密闭的容器中进行，配合加热温度控制系统，可以根据具体的实验要求加热并控制样本温度，维持实验条件所需的温度条件，保证液体混合达到实验需求，以加快反应速度或者蒸发速度[2]。

     [1]衷友泉，万屏南主编；杨婕，林艳，程林等副主编. 中医药基础化学实验 第3版. 北京：中国协和医科大学出版社,

[2]许晓风主编；周学，袁学智，夏文静，张亮，吴金龙，姜海建副主编. 大学实验室基础训练教程--化学与生物专业[M]. 南京：东南大学出版社,

【问题13】NaCl在培养基中的作用仅仅是调节渗透压吗？

【解答】 钠离子不参与细胞的组成，但仍是微生物发酵培养基的必要成分，钠离子与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加入少量的钠盐，但用量不能过高，否则会影响微生物的生长。    氯离子在一般微生物中不具有营养作用，但对一些嗜盐菌来讲是需要的，在一些产生含氯代谢物的发酵中，除了从其他天然原料和水中带入的氯离子外，还需加入一定量的氯化物补充氯离子。特别是有的嗜盐菌，需要达到一定的盐浓度才能激活体内的某些酶才能生长正常的；高钠离子浓度可以维持细胞壁结构完整，同时保证细胞功能正常。极端嗜盐菌的生长不仅需要高浓度的钠离子，并且还需要适当浓度的钾离子以维持细胞内外盐浓度的平衡[1]。此外，嗜盐菌中嗜盐酶需要在较高盐浓度才能保证其结构与活性的稳定；嗜盐菌细胞膜外有由磺化的糖蛋白组成，由于磺酸基团的存在使其呈负电性，在高盐环境中保持稳定，同时这些糖蛋白由于负电性可以在细胞壁外表面束缚Na+，维持细胞完整性[2]。

在固体培养基培养时，细菌在利用基质时能同时吸收NaCl，在体内也能起到类似的作用即维持渗透压的作用。

[1]王伟伟，唐鸿志，许平. 嗜盐菌耐盐机制相关基因的研究进展[J]. 微生物学通报，-558

【问题14】什么是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳

【解答】琼脂糖是从红色海藻产物琼脂中提取的一种多糖，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖以B-1,4-糖苷键和a-1,3-糖苷键交替连接构成[1]。琼脂糖凝胶电泳条件简易，操作简单，多用于鉴定较大（50-20000bp）的核酸片段，可用于分析核酸含量、分子量、纯度的测定。而聚丙烯酰胺凝胶电泳具有浓缩、电泳和分子筛三种效应，有很高的分辨率，常用作蛋白质的分析，该方法可以分析蛋白质的亚基组成及其分子量[2]。SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定比例和蛋白质结合成复合物，因被鉴定的蛋白质样品很纯，几乎只含有具四级结构的血红蛋白，其四个亚基的相对分子质量很相似，所以经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，只出现一条蛋白质区带[2]。

[2]柳志强主编. 分子微生物学实验指导[M]. 北京：中国轻工业出版社, 2017.07:48

【问题15】什么是斜面接种和穿刺接种？

【解答】斜面接种具体操作方法是，左手持斜面培养基试管，试管口缓缓过火灭菌2-3次，用右手小指和手掌打开斜面培养基试管塞，在火焰旁将沾有菌种的接种环伸入斜面试管，从斜面培养基的底部向上做“Z”字形来回密集划线，切勿划破培养基。然后取出接种环，试管口过火灭菌，并于火焰旁盖上试管塞；然后灼烧接种环，尤其是环端部分，务必烧至通红，熄灭酒精灯。该方法主要用于细菌的转种分纯或扩大培养，使其增殖后用于鉴定或保存菌种[1]。

穿刺接种所用接种工具是接种针（针必须挺直），培养基一般是半固体培养基。操作办法是：用接种针挑取菌种，自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上试管塞，烧灼接种针。在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法[2]。

[1]秦浩正总主编；邹淑君分卷主编. 中学生学习辞典 生物卷. 上海：世界图书上海出版公司, 2012.09:293.

[2]叶磊，杨学敏主编. 微生物检测技术[M]. 北京：化学工业出版社, 2009.06:84.

【问题16】释放红细胞中的血红蛋白为什么要用甲苯？

【解答】人教版选修一“血红蛋白的提取和分离”实验中释放红细胞中的血红蛋白除了加和原血液等体积的蒸馏水之外，还要用40%体积的甲苯，其原因如下：

血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α-肽链和两条β-肽链，其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，其四级结构中，疏水性的侧链趋向于包埋在内部，亲水性侧链则是暴露在蛋白质表面，故血红蛋白溶于水，不溶于有机物[1]；细胞膜主要成分是脂质和膜蛋白，膜蛋白中的内在膜蛋白和部分脂锚定蛋白不溶于水，溶于有机溶剂。综上所述，红细胞中溶于水的蛋白质主要是血红蛋白[2]。甲苯是有机溶剂，能溶解不溶于水的物质，加入甲苯的作用主要是溶解红细胞的细胞膜上脂质和能溶于有机溶剂的蛋白质。

[1]】王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学[M].北京:高等教育出版社,-312.

[2]翟中和,王喜忠,丁明孝.细胞生物学[M].北京:高等教育出版社,.

【问题17】透明圈大小能反映纤维素酶的活力吗？

【解答】纤维素酶是一种复合酶，由 C1酶 、Cx酶和葡萄糖糖苷酶组成。在实践中，测定这三种组分酶酶活力所用底物分别是脱脂棉、 CMC-Na和对硝基酚-β -葡萄糖苷；而测定纤维素酶总活力时，用的底物是滤纸，能综合反映3种组分酶的协同作用。教材中的鉴别培养基中的碳源CMC-Na是可溶性的，菌落透明圈大小只能表征Cx酶活力高低，并不能反映微生物分解纤维素的真实能力[1]。只能粗略估计菌株产酶情况，不能真正代表菌株的产酶能力，仅以水解圈大小作为菌株产纤维素酶活力大小的唯一定量指标是不大可靠的。

如果用滤纸作为底物，其结构较松散，容易被纤维素酶的三种酶降解成葡萄糖等还原糖，此时用比色法定量测定还原糖的生成量，即可反映纤维素酶的总酶活力[2]。

[1]马怀良等.“分解纤维素的微生物的分离”实验中鉴别培养基的改进[J]. 生物学教学,2010,35（3）:46.

[2]郝月,杨翔华,张晶,周东凯,金贤子.秸秆纤维素分解菌的分离筛选[J].中国农学通报,2005,(7):58-60.

【问题18】微生物培养中为何要倒置平板？

【解答】一、接种之前倒置平板的原因：

1.刚倒完平板，培养基凝固不久，水分较多。如果正放，冷凝水会流入培养基，不仅造成污染，而且使培养基与培养皿分离，此外接种后培养基中菌株会四处流动，菌膜连在一起，不能计数[1]；

2.如果正放，取放平板容易将培养皿盖碰开，导致污染杂菌。

二、接种后培养时倒置平板的原因：

1.如培养条件必须通风，可以减少培养基表面空气流动，减慢培养基水分蒸发，保持固体培养基中的水分，有利于菌种的繁殖和生存；

2.倒置的平板内空气不易流动，能尽可能减少外来杂菌的侵染；

3.平板倒置进行微生物培养时，受重力的影响，一方面培养基中的营养物质主要会富集在培养基表面及表面以下的次层，有利于微生物生长；另一方面培养基表面生长的菌落相对不会太快扩散，观察时有利于辨别菌落特征。倒置培养时水珠也少, 方便观察计数。

[1]李洪伟.微生物培养中平板倒置的原因浅析[J].生物学教学,2016,12：61.

[2]龙建友,阎佳主编.环境工程微生物实验教程[M].北京：北京理工大学出版社, 2019.01:77.

来源：专学自然/编辑：小呆呆

当目标蛋白的物理特性如分子量、等电点等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同pH缓冲液的试管中，可简单地测出pI， 并确定纯化用缓冲液的最佳pH。

在对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：
　　一、使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广泛的介质如Superose、Sephacryl HR根据分子量将样品分成不同组份。
　　二、用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。也可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一部即可得到高纯度样品。
　　三、大体积的样品、常使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。

处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用Sepharose Big Beads、SepharoseXL、Sepharose Fast Flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE截止，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一，提高回收率，缩短纯化周期。

硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，先用HiTrap HIC Test  Kit和RESOURCE HIC Test KIT可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其他吸附性层析。

固化外源凝集素如刀豆球蛋白、花生、大麦等的凝集素，结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组分、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，可俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。

膜蛋白分离长使用去污剂使其保持活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白电荷相反者，以避免在作离子交换时蛋白竞争交换介质，藉此除去去污剂。非离子性去污剂可用疏水层析法除去。

单抗多为IgG，来源主要是腹水和混合瘤培养上清夜。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Protein G和ProteinA对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步醇化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的栽量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein

重组蛋白在设计、构建时应已融化入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合作粗分离。

包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或尿素中。高化学稳定性的Sepharose12及Sepharose  6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白质需要复性至蛋白的天然构象。Superdex75、Q Sepharose FF和pheny1 Sepharose FF 分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高复性效果越好。SOURCE 30  RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以使1M NaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收效率明显提高。

将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白聚体的形成，所以复性锝率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。

固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组胺酸融合蛋白；以及以HiTrap   Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用。

中药的化学成分极其复杂。传统中药多是前熬后服用，有效成分多为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合地利用多种层析方法，如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛选功能，例如，用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex  LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内酯、萜类、甾类等。

生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap  SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常相似的生物碱。相反，黄酮、醌类、皂甙、有机酸等可溶预溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。一般多糖纯化大多使用分子筛，如Sephadex，Sephacry1。若分子量在60万以下，并需更高等分辨率，可选择新一代的Superdex。一种植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组分纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏反应的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。 SURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SURCE反相层析可用范围为PH1-14，并可用1M NaOH、1M HCI清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。

肽类的来源有天然萃取、合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可以从有机溶剂或促溶剂中复性，所以以高选择性的反相层析如Sephasil、PepRPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换作纯化。Superdex Peptide  HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析作出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30

核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如Mono Q、SOURCE Q分离核酸。

寡核苷酸多应用在反义（anti-sense）DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等的研究。合成后含三苯甲基的寡聚核苷酸译音离子、以阴离子交换的MonoQ或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可去除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。

使用凝胶过滤介质Sephadex G10、G15、G25、G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap

使用凝胶过滤介质Sepharoce 4FF纯化疫苗，去除培养基杂蛋白，处理量可大于床体积10%。柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。目前使用该方法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacry S-500 HR，如甲肝疫苗等。

《中国药典》自2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的百分比，规定使用Sephadex G10凝胶过滤去测定。

Industry》，提供了帮助行业开发寡核苷酸疗法的建议，涉及药代动力学、药理学和安全性评估。《指南》就何时进行这些评估以及何种类型的评估适合解决哪些问题提供了建议。
      为了满足寡核苷酸药物的研发需求，汇智泰康凭借多年来在生物医药研发、生物安全评价和分析检测领域积累的技术、方法和项目经验，开发了针对寡核苷酸药物的血浆蛋白结合试验方法，构建了寡核苷酸药物的临床前药物研发服务体系，可以承接寡核苷酸药物临床前实验相关研究工作。具体描述如下：

 PPB通过检测药物入血后与血浆蛋白结合形成结合态药物的比例，判断药物在血浆中的存在形式，为药物作用机理研究、药物活性研究、用药方法研究等提供参考数据。实验过程包括：RNA与蛋白结合孵育过程，游离药物分离过程（可根据药物特点选用平衡透析法（ED）、超滤法（UF）、固相萃取法（SPE）等）和游离药物检测（可选用高效液相-（LC-MS、LC-MS/MS）、荧光标记RNA的液相色谱-荧光检测（LC-FLD）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-q）检测法等。血浆可以根据需要选择人、猴、犬、大鼠、小鼠等不同种属。


某RNA-荧光标记物的色谱图

 代谢稳定性实验，如血浆代谢稳定性、肝微粒体代谢稳定性、肝细胞代谢稳定性等，均可涉及人、猴、犬、大鼠、小鼠等多个种属。对于血浆代谢稳定性，可以通过LC-MS/MS测定从血浆中提取(可采用Trizol提取法、蛋白K酶消解法、固相萃取法、磁珠杂交提取法等)得到的RNA。对于肝微粒体代谢和肝细胞代谢，可以先应用LC-MS/MS和Triple QTOF-MS对其代谢产物进行鉴定，进而应用LC-MS/MS进行定量分析。
       药物代谢性相互作用研究，可根据国家药监局药审中心发布的《药物相互作用研究技术指导原则（征求意见稿）》开展相关实验和研究。

3.动物药理药效安全评价实验

       可开展大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、兔、猴、小型猪、犬等临床前研究动物实验。
  汇智泰康寡核苷酸药物研发相关配套：

3.酶标仪（美国博腾ELx808等）

4.蛋白纯化仪（利穗科技APPS 50D等）

5.一体化凝胶成像仪（北京赛智SmartGel 140等）

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