第四部分 临床免疫学检验
现代免疫的概念是机体免疫系统识别和排斥抗原性异物的一种特异性生理功能。这种反应在生理条件下对机体有利，在病理条件下对机体有害。
免疫功能主要表现为以下三种生理功能：
（1）免疫防御：指机体排斥微生物的侵袭及其他外源性抗原异物的能力。过高产生超敏反映；过低引起免疫缺陷病。
（2）免疫自稳：机体识别和清除自身衰老残损的组织、细胞的能力，借以维持正常内环境稳定，失调时引起自身免疫病。
（3）免疫监视：机体杀伤和清除异常突变细胞的能力，一旦功能低下可导致肿瘤发生或病毒持续感染。
1、免疫应答概念、特征
免疫应答是机体免疫系统接受抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解该抗原物质为目的的反应过程。免疫应答反应的重要特征是识别自身和非己、特异性和记忆性。免疫应答包括固有免疫应答和适应性免疫应答。
（1）固有免疫应答：在正常机体内任何时段均以抗原非特异性方式识别和清除各抗原异物和病原体，称为非特异性免疫应答，如人体的血脑屏障、胎盘屏障、皮肤屏障。
（2） 适应性免疫应答：免疫细胞在机体选择识别某种抗原后，自身活化、增殖、分化为免疫效应细胞，产生免疫效应分子，排除该抗原的全过程，也称为特异性免疫应答。
免疫应答的基本过程分为识别阶段、淋巴细胞活化阶段和效应阶段。
（1）识别阶段：指巨噬细胞、树突状细胞和活化B细胞等抗原提呈细胞摄取和加工处理抗原并提呈抗原肽供T细胞识别，此过程又称为感应阶段。
（2）淋巴细胞活化阶段：指接受抗原信号后的T、B淋巴细胞在一系列免疫分子参与下，发生活化、增殖和分化的阶段。其中T淋巴细胞接受抗原刺激和协同刺激信号后活化、增殖和分化为效应T细胞，并合成细胞因子；B淋巴细胞接受抗原刺激后活化、增殖和分化为浆细胞产生抗体。此过程又称为反应阶段。
（3）效应阶段：抗体、Tc、TD或细胞因子等对抗原发挥免疫效应的阶段。
3、体液免疫应答和细胞免疫应答
适应性免疫应答根据淋巴细胞发挥的效应可分为B细胞介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫。
（1）B细胞介导的体液免疫：根据抗原性质不同分为对胸腺依赖性抗原（TD抗原）和对胸腺非依赖性抗原（TI抗原）。经抗原刺激后，B淋巴细胞活化、增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成分泌抗体发挥作用。）
（2）T细胞介导的细胞免疫：是由抗原提呈细胞摄取加工TD抗原，并选择相应抗原肽提呈给T细胞；T细胞接受抗原信号和协同刺激信号后，活化、增殖和分化为效应T细胞。其中Th1细胞合成分泌多种细胞因子，可引起迟发型超敏反应；Tc细胞则直接杀伤表达相应抗原的靶细胞及诱导靶细胞凋亡。细胞免疫主要发挥抗细胞内寄生菌感染、抗病毒感染、抗寄生虫感染与抗肿瘤免疫效应。
三、免疫组织及免疫器官
免疫系统是由免疫器官、免疫组织、免疫细胞和免疫分子组成，是机体免疫应答发生的场所。
分为中枢免疫器官和外周免疫器官。
（1）中枢免疫器官：是免疫细胞发生、分化和发育成熟的场所，包括骨髓、胸腺和鸟类法氏囊。
①骨髓：在骨髓中，多能造血干细胞分化、发育生成B淋巴细胞。
②胸腺：是T淋巴细胞分化成熟的场所。
（2）外周免疫器官：是免疫细胞聚集增殖和免疫应答发生的场所。包括淋巴结、脾及粘膜相关淋巴组织等。
①淋巴结：是成熟T细胞和B细胞定居增殖的组织。
②脾：是富含血管的最大的外周淋巴器官。
③伴随的淋巴组织：如扁桃体、小肠Peger集合淋巴结、阑尾等。
凡参与免疫应答以及与免疫应答有关的细胞统称为免疫细胞。按作用方式可分为淋巴细胞、单核-巨噬细胞以及其它免疫细胞（包括粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和肥大细胞等），其中免疫活性细胞主要指淋巴细胞。
免疫细胞依其参与免疫应答类型不同可分为非特异性的固有免疫细胞和特异性的适应性免疫细胞两大类，其中适应性免疫细胞主要包括专职抗原提呈细胞、T淋巴细胞与B淋巴细胞。
外周血中T细胞占淋巴细胞的70%～75%，主要功能是：抗原识别、细胞免疫、免疫调节。T细胞表面标志分表面受体及表面抗原两类。
（1）T细胞受体（TCR）：又称T细胞抗原受体，由膜分子TCR和CD3构成的复合体，是所有成熟T细胞的独特标志性膜蛋白分子，可表达于所有成熟T细胞表面，接受并转导T细胞活化的抗原信号（第一信号）。人类免疫缺陷病毒（HIV）选择性感染CD4+T细胞，使CD4+T细胞减少。而致有丝分裂原受体可使丝裂原刺激静止期淋巴细胞转化为原淋巴细胞，发生有丝分裂而增殖。实验室常用植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白A（ConA）作原淋巴细胞转化率的试验。
（2）簇分化抗原（CD）：是有核细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的淋巴细胞可表达不同的分化抗原，是区别淋巴细胞的重要标志。T细胞主要CD抗原有：
①CD2：表达于全部人T细胞和NK细胞表面，是成熟T细胞的特有标志，主要配体是CD58，又称绵羊红细胞受体（E受体），可利用结合绵羊红细胞的E花环试验测定外周血中T细胞总数。
②CD3：表达在全部T细胞表面，是T细胞共同的表面标志，与TCR构成复合体共同识别抗原并传导活化第一信号。
③CD4/CD8：MHC分子受体表达于外周血不同T细胞亚群表面，是区别T细胞亚群的重要标志，成熟TCRαβ-T细胞依据细胞膜的CD4/CD8分子分为CD4+T细胞和CD8+T细胞2个亚群。表达CD4主要是辅助性T细胞（Th）：Th细胞膜表达CD4分子，可特异识别结合MHC-II类分子提呈的相应外源性抗原肽，活化为Th1和Th2细胞。表达CD8主要是细胞毒性T细胞（CTL或Tc）：Tc细胞膜表达CD8分子，可特异识别结合MHC-I分子提呈的相应内源性抗原肽而被活化。
③协同刺激分子及受体：CD28：与抗原提呈细胞膜表面配体CD80/ CD86分子结合后，接受T细胞活化的第二信号。CD154（CD40L）：与B细胞膜表面的CD40结合后，提供B细胞活化第二信号。
④丝裂原受体：T细胞膜上特有植物血凝素（PHA）受体和刀豆蛋白A（ConA）受体，此外T细胞与B细胞膜上都表达有美洲商陆(PWM)受体，静息T细胞与PHA/ConA/PWM结合后可活化、增殖和分化。
T细胞表面具有SRBC受体、丝裂原受体、抗原受体及白细胞介素受体。
Th细胞：主要功能是免疫调节：①Th1细胞，主要通过分泌多种细胞因子参与细胞免疫；②Th2细胞，主要功能是调节体液免疫应答，通过提供B细胞活化第二信号（协同信号）和细胞因子，辅助B细胞活化及转化为浆细胞合成抗体。
Tc细胞：主要效应是直接杀伤带有相应Ag的靶细胞（如病毒感染细胞、肿瘤细胞等）或诱导靶细胞凋亡。具有特异杀伤、溶解靶细胞作用。
B细胞受抗原刺激后分化为浆细胞产生抗体，主要免疫功能有：产生抗体；摄取、加工与提呈抗原；分泌细胞因子参与免疫调节。
（1）B细胞的表面标志
①膜免疫球蛋白（mIg）：又称BCR，是由膜免疫球蛋白（mIg）与CD79聚合构成，是B细胞最具特性的表面标志，接受并转导B细胞活化的抗原信号（第一信号），主要作用是结合抗原，未成熟B细胞膜一般只表达mIgM，成熟B细胞的mIg主要为mIgM、mIgD。
②CD5分子：根据有无表达CD5，可将B细胞区分为B1（CD5+）、B2（CD5-）细胞两个亚群。
③CD21分子：是B细胞上的EB病毒受体，是B细胞活化辅助受体的一个组成部分。
④丝裂原受体：B细胞膜特有的丝裂原受体是脂多糖（LPS）受体和葡萄球菌A蛋白（SPA）受体，也表达美洲商陆（PWM）受体。静息B细胞与LPS/SPA/PWM结合后可活化、增殖和分化。
⑤CD32：B细胞抑制性辅助受体，EAC花环。
⑥协同刺激分子及受体：CD40：表达于成熟B细胞膜表面。CD40与活化T细胞膜上的CD154（CD40L）结合后，接受B细胞活化必需的第二信号；CD80/CD86（也分别命名为B7-1/B7-2）：主要表达于活化B细胞。CD80/CD86与T细胞膜CD28结合后，T细胞获得活化第二信号。
（2）B细胞功能：①分化为浆细胞合成抗体；②摄取、加工与提呈抗原；③分泌细胞因子参与免疫调节。
吞噬细胞包括单核-吞噬细胞系统和中性粒细胞，其共同特性是表达MHC-II类分子及具有吞噬作用。
自然杀伤细胞（NK细胞）是一类不表达特异性抗原受体的大颗粒淋巴细胞，没有独特的膜标志，
NK细胞无需抗原刺激，可分泌穿孔素和细胞因子直接杀伤微生物感染细胞和肿瘤细胞（靶细胞），可通过“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）”杀伤靶细胞，也可诱导靶细胞凋亡，是执行免疫监视功能的重要细胞。目前将CD56+、CD16+、CD94+、TCR-、BCR-、CD3-的淋巴样细胞鉴定为NK细胞。NK细胞是固有免疫应答细胞，其主要功能有：①抗肿瘤免疫；②抗细胞内感染免疫；③分泌IFN-γ、TNF-β等细胞因子，参与免疫调节作用。
吞噬细胞包括血液中的单核细胞和中性粒细胞以及组织中的巨噬细胞。单核-巨噬细胞的免疫功能有：①吞噬作用：单核-巨噬细胞能直接吞噬和杀伤病原微生物；②摄取、加工和提呈抗原：Mφ是一类专职抗原提呈细胞，可利用MHC-П分子给CD4+T细胞提呈外源性抗原肽；③调节免疫应答：Mφ对免疫应答具有正调节或负调节的双向调节作用；④抗肿瘤作用：充分活化的Mφ能直接吞噬肿瘤细胞或杀伤肿瘤细胞；⑤参与局部炎症反应：Mφ合成分泌TNF-α、IL-1、IL-6及LTB4等炎性介质引起局部炎症反应。
（1）抗体(Ab)：是B淋巴细胞受抗原刺激、增殖分化为浆细胞后合成并分泌至血液和体液中，能与该抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。
（2）免疫球蛋白（Ig）：是所有具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。免疫球蛋白可分为分泌型（sIg）及膜型(mIg)。所有的抗体均是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗体。
Ig分子是一“Y”字形四肽链结构，由4条肽链借链间二硫键连接组成。单体Ig分子是由2条相同重链（H链）借二硫建在中部相连，而2条相同轻链（L链）又借二硫建各与一条重链（H链）连接，形成一种对称性四肽链分子。
① L链：按抗原性差异分为κ和λ型，其中λ型又分为4个亚型。同一种Ig分子的2条L链都是同型的，即都是κ型或都是λ型，不会是混型的。
② H链：按抗原性差异分为γ、α、δ、ε、μ五类，因此Ig也相应地分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。分别是重链为γ类型的IgG（分为IgG1、2、3、4亚类）、重链为α类型的IgA（分为IgA1、2亚类）、重链为μ类型的IgM、重链为δ类型的IgD、重链为ε类型的IgE。每一个Ig单体分子的2条H链也是同类型的，不会是混型的。
Ig的三维结构含有若干功能区，每一功能区大约由110个氨基酸残基的区段组成，该区段内有一对链内二硫键，使这一区段肽链折叠构成一个球状结构域，每一结构域都有一定的功能。
①易变区（V区）：Ig的L链和H链N端的第一个结构域因氨基酸顺序多变称为易变区，分别为VL和VH。VL和VH经β折叠形成抗原结合腔，能与对应抗原决定基在空间构象上精确互补而特异结合。
②恒定区（C区）：V区以外的部分，Ig的L链和H链C端氨基酸组成和排列较恒定称为恒定区，分别为CL和CH。CL的抗原性是Ig分型或亚型的依据，而CH的抗原性是Ig分类或亚类的依据。此外CL和CH还可能分布有个体遗传标志抗原位点，C1区由CL与CH1区构成；C2由两个CH2构成，IgG的CH2与补体C1q结合可激活补体；C3由两个CH3构成，IgG的CH 3与IgG
FCR结合发挥其免疫调节作用，IgM的C3区有补体结合位点；IgM和IgE还有一个C4区，由两个CH4构成，IgE的CH4与肥大细胞膜上IgE FCR结合则引发Ⅰ型超敏反应。
③铰链区：是Ig的CH1 和CH2间的结构松散可展开改变Ig构型的肽段。铰链区不易形成α螺旋，富有弹性，张合自如，抗体分子的这种变构性质使补体结合位点易于暴露。
IgG的铰链区二硫键两端有木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的水解位点。
木瓜蛋白酶在IgG的铰链区二硫键的N端裂解使之成为三个片段：两个相同的Fab和一个Fc段。Fab由L链和VH- CH1构成，保留了可变区完整的抗原结合区称为抗原结合片段；Fc由两条H链的CH2 和CH3区构成称为可结晶片段，Fc段可与细胞膜表面相应Fc受体结合，介导免疫细胞发挥免疫效应。
胃蛋白酶水解IgG分子，则从铰链区双硫键的近C端裂解，将IgG裂解为大小两个片段。大片段F（ab’）由2个Fab借铰链区二硫键连接而成，保持完整IgG与抗原结合的功能；小片段PFc’进一步酶解为无抗原性、无任何生物活性的小分子肽。
5、各类免疫球蛋白的特征与功能
（1）IgG：IgG是血清和组织液中含量最多的免疫球蛋白（约占血清Ig总量的80%），多为单体，少量以多聚体形式存在，约有50%IgG在血清中，其余广泛分布于各组织的细胞外液中。分子量最小。
①IgG是主要的抗感染抗体，大多数抗菌抗体、细菌毒素或病毒的中和抗体都是IgG，是再次免疫应答的主要抗体也是唯一能通过胎盘的抗体。
②保护胎儿和新生儿，是胎儿和新生儿的被动抗感染抗体。
③激活补体经典途径，IgG1、IgG3与抗原特异结合后，可高效激活补体经典途径，导致溶血及溶细胞效应。而IgG4只能参与替代途径。
④介导免疫细胞效应，IgGV区特异性结合抗原后，其Fc段可与Mф、NK细胞表面的Fc受体结合，发挥免疫调理和ADCC作用等。
⑤参与免疫病理损伤，IgG1、2、3可参与II、III型超敏反应和自身免疫性疾病，而IgG4可参与Ⅰ型超敏反应。
（2）IgA：IgA有2种存在形式：①血清型：主要由肠系膜淋巴组织的浆细胞产生，血清中绝大多数IgA是单体。具有抗菌、抗毒、抗病毒作用。②分泌型（SIgA）：由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处黏膜固有层中的浆细胞产生，为二聚体，每一SIgA分子含一个J链和一个分泌片。SIgA是各种粘膜细胞外分泌液中的主要抗体，也存在于部分腺体分泌液中，如乳汁（初乳中含量最多的抗体是SIgA）、唾液、泪液。婴儿可从母乳中获得SIgA，是一种重要的被动免疫。SIgA性能稳定，局部浓度大，是参与黏膜局部免疫的主要抗体。
（3）IgM：是初次体液免疫应答早期阶段产生的主要Ig，主要产生于脾和淋巴结抗全身感染的作用较强。IgM主要有2种存在形式：①单体IgM：是表达于B细胞
膜表面mIgM，参与构成BCR复合体，选择识别与结合抗原。②血清型IgM：5个单体IgM借J链链接为五聚体，是分子量最大的抗体（970kD）不能通过血管壁，主要存在与血清中。其重要免疫功能有：血液抗感染抗体，因含10个抗原结合区，具有很强的抗原结合能力，是重要的血液抗感染抗体；激活补体经典途径，
IgM的CH3区共有10个补体结合位点，是激活补体的能力最强的抗体；宫内感染诊断依据，在胎儿发育后期（约20周）开始有合成IgM的能力，由于母体IgM不能通过胎盘进入胎儿体内，因此如果脐带血或新生儿血液中特异性IgM量较高的话，则提示新生儿曾受到宫内感染；早期感染诊断依据，机体受抗原刺激后
最先合成IgM，接着是 IgG。当大量IgG合成时，IgM合成量则相应减少。因此，检查血清特异性IgM含量可用作传染病的早期诊断。
（4）IgE：IgE主要由黏膜下淋巴组织的浆细胞分泌，单体结构，其重链含5个功能区，是正常人血清中含量最少的Ig（0.3μg/ml）。IgE具有很强的亲细胞性，其Fc段可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ结合，介导Ⅰ型超敏反应。此外IgE还参与机体抗寄生虫免疫。
（5）IgD：IgD为单体结构，血清IgD的生物学功能尚不清楚，仅占血清总量的0.2%。mIgD参与构成BCR，成熟B细胞同时表达。mIgM和mIgD。
5类免疫球胆白在人体的含量顺序IgG＞IgA＞IgM＞IgD＞IgE。
6、目前临床上免疫球蛋白（除IgE外）定量的最佳方法是：免疫浊度试验（速率散射比浊法）。免疫球蛋白测定最常用的方法为免疫比浊法。
抗原是指能启动机体免疫应答，并能与相应的免疫应答产物（抗体或效应靶细胞）在体内或体外发生特异性结合的物质。
一个完整的抗原一般具有两个特性：免疫原性和免疫反应性（抗原性），免疫原性是指抗原能刺激机体产生免疫应答，诱导机体产生抗体或效应淋巴细胞的能力。抗原性是指抗原与所诱导诱导机体产生抗体或效应淋巴细胞发生特异性结合反应的能力。具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原，仅具备抗原性而无免疫原性的物质称为不完全抗原或半抗原。
2、人体的隐蔽抗原有眼球内部的晶体蛋白、甲状腺球蛋白、脑组织、精子等。
3、抗原的分子量越大、化学结构越复杂，免疫原性越强。
4、抗原特异性的决定因素是抗原决定簇。
5、不同抗原具有相同或相似抗原决定簇是导致抗原与抗体结合发生交叉反应的主要原因。
（1）异种抗原：指来自于另一物种的抗原，如病原微生物、细菌外毒素和类毒素、动物免疫血清等。
（2）同种异型抗原：指同一种属不同个体之间存在的抗原性物质。如血型抗原、HLA。
（3）异嗜性抗原：是一类与种属特异性无关，存在于人、动植物和微生物之间的共同抗原，如溶血性链球菌表面成分与人肾小球基底膜及心肌组织具有共同抗原。
（4）自身抗原：在正常情况下，机体对自身组织细胞不会产生免疫应答，即自身耐受。
补体系统是存在于人和脊椎动物正常新鲜血清及组织液中的一组具有酶样活性的糖蛋白，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，当被某种物质激活后，表现出多种酶活性和其他生物学效应。血清中90%的补体是在肝脏中合成的，肝细胞和库普弗（Kupffer cell）细胞是主要合成细胞。
补体的化学成分是糖蛋白，在电泳时，大多数属于β球蛋白，少数属α（如C1s和D因子）和γ球蛋白（C1q）。补体化学性质很不稳定，易受各种理化因素影响；在0～10℃下活性只保持3～4天，冷冻干燥可较长时间保持其活性；不耐热，56℃ 30min可灭活；强酸强碱、强烈振荡、乙醚、乙醇、蛋白酶等均可使其灭活，甚至离体存放时间稍长，活性也会逐渐丧失。
补体激活主要有经典途径、甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径和旁路途径等三条途径。
（1）经典途径：补体C1～C9共11种成分全部参与的激活途径，可分为识别阶段、活化阶段、膜攻击阶段。
①识别阶段：激活物质是抗原抗体复合物，从激活C1q开始，由C1q激活C1r，最后形成蛋白酶C1s，底物是C4和C2。
②活化阶段：C1s顺序水解C4和C2，由C4和C2的水解大片段组成C4b2b复合物，此即C3转化酶；C3转化酶水解C3，大片段C3b与C4b2b组成C4b2b3b，此即C5转化酶。
③膜攻击阶段：C5转化酶将C5水解成C5a和C5b，C5b结合于细胞膜并依次激活C6、7、8、9。多个C9分子聚合形成一管状结构插入膜内，穿透细胞膜导致细胞溶解。
经典途径的补体激活顺序：C1、4、2、3、5、6、7、8、9。
⑵替代途径：又称旁路途径，由病原微生物等细胞壁成分（脂多糖、肽聚糖等）直接提供接触面直接激活补体C3，然后完成C5～C9的激活过程。
①激活物质：主要是微生物细胞壁糖类物质（如脂多糖、酵母多糖、葡聚糖等）、
（3）甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径：由急性炎症期产生的甘露糖结合凝集素（MBL）与病原体结合后启动激活。MBL首先与细菌细胞壁的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合，形成MBL相关的丝氨酸蛋白酶（MASP），MASP可水解C4和C2分子，产生C4b2b共同构成与经典途径相同的C3转化酶，其后续激活阶段与经典途径相同。
（1）补体的溶细胞作用：能溶解细菌（但一般不溶解革兰氏阳性菌）、真菌、包膜病毒、寄生虫，也可溶解自身组织细胞。
（2）溶解免疫复合物（IC）：防止免疫复合物在体内沉积。
（3）介导免疫细胞效应
免疫调理作用：如中性粒细胞、巨噬细胞等通过其膜表面CR1与细菌细胞膜表面的C3b结合，把细菌固定在吞噬细胞表面，有利于吞噬。C3b+C4b参与吞噬调理作用。
免疫黏附作用：红细胞膜上有CR1，当C3b与Ag-Ab免疫复合物（IC）结合后，红细胞通过CR1将C3b-IC黏附在其膜表面，携带至肝脏交给库普弗细胞吞噬清除。
炎症介质效应：①过敏毒素作用：补体活化过程中产生多种具有炎症介质的活性片段，如C5a、C4a、C3a等，C5a和C3a被称为过敏毒素，它们可与肥大细胞或嗜碱粒细胞表面C3aR和C5aR结合导致肥大细胞和嗜碱粒细胞脱颗粒，引起超敏反应；②趋化作用：C5a和C3a和C567具有吸引吞噬细胞到炎症部位聚集发挥吞噬作用，增强炎症反应，因此也称为趋化因子；③激肽样作用：C2a和C4a可直接引起血管扩张和通透性增加，造成炎症性充血。
（1）补体总活性测定-CH50以50%溶血作为终点指标，它比100%溶血更为敏感，称为补体50%溶血实验，即CH50。
（2）CH50试验是测定经典途径总补体溶血活性，所反映的是补体9种成分的综合水平。
（3）补体结合试验中有5种成分参与反应，分属3个系统：①反应系统；②补体系统；③指示系统。其反应系统（抗原与抗体）与指示系统（绵羊红细胞与溶血素）争夺补体系统。出现溶血，为补体结合试验阴性。
（4）C3缺陷可导致严重感染；C1抑制物缺陷与遗传性血管性水肿有关；
（5）补体含量显著降低的疾病：①补体消耗增多见于SLE、自身免疫性溶血性贫血、类风湿关节炎、移植排斥反应；②细菌感染，特别是革兰阴性菌感染时；③大量丧失见于大面积烧伤、大出血和肾病综合征；④合成不足则见于急、慢性肝炎，肝硬化、肝癌和营养不良等。
6、血清中含量最多的补体是C3，最少的是C2。
细胞因子（CK）是指由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，是细胞间的信息传递分子。
CK主要参与调节免疫应答、免疫细胞分化发育（IL2）、组织修复、介导炎症反应、刺激造血功能（IL3）、抗病毒及抗肿瘤等。
细胞因子的特点：（1）无抗原特异性，通过与受体结合发挥效应。（2）高效应性；（3）多源性，一种因子可以由多种细胞分泌；（4）以旁分泌、自分泌、内分泌的形式发挥作用；（5）多效性，一种因子可以作用于不同的细胞。
按生物学功能可分为六大类：
（1）白细胞介素（IL）：在多种细胞间发挥广泛作用的细胞因子。IL2可以促进T、B淋巴细胞的增值分化，IL3可以刺激造血功能，IL6可以诱导肝细胞合成α1-AAT。IL2在肾移植排斥有诊断意义。
（2）干扰素（IFN）：具有干扰病毒复制的作用，是细胞受病毒核酸或某些诱生剂刺激后合成分泌的细胞因子，人干扰素分为IFN-α 、IFN-β、 IFN-γ。
（3）肿瘤坏死因子（TNF）：是一种能使肿瘤发生出血性坏死的细胞因子。TNF-α主要由活化的单核-巨噬细胞等产生，可参与炎症、疾病进展及恶病质形成、诱导细胞凋亡、抗肿瘤作用等。TNF-β主要由活化的Th1细胞产生，具有细胞毒作用，又称淋巴毒素。
（4）集落刺激因子（CSF）：是一种能够刺激多能干细胞和前体免疫细胞进行增殖分化的细胞因子。种类有粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、单核-巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。IL3也是CSF，可刺激所有未成熟的免疫前体细胞发育分化成熟，也称为多能集落刺激因子。
（5）趋化因子：主要由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌，具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的趋化和激活活性。
（6）生长因子（GF）：指具有刺激或抑制细胞生长作用的细胞因子，如表皮细胞生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）、转化生长因子-β（TGF-β）等。
（一）抗原抗体反应概念与原理
体外抗原抗体反应是指抗体与相应抗原在体外特异性结合后，可因抗原或抗体的物理性状不同以及参与反应的物质不同而出现各种反应现象，如凝集、沉淀、补体结合及中和反应等。由于抗原与抗体反应具有高度特异性，因此可以利用已知抗体鉴定标本中的未知抗原（或反过来）。
（1）抗原抗体结合力：指抗原依赖抗原决定基（表位）和抗体的抗原结合部位的空间构象精确互补特异结合，这是一种非共价键的可逆结合，不形成共价键，取决于抗体的亲和性和亲和力，需要四种分子间引力参与。①静电引力（库伦引力）；②范德华引力（作用最小）；③氢键结合力（最具有特异性）；④疏水作用力（是这些结合力中最强的，对维系抗原抗体结合作用最大）。
（2）抗原抗体亲和力：抗原抗体的亲和性取决于两者空间构型互补的程度。用平衡常数K表示。亲和力指抗体结合部位与抗原表位间结合的强度，它是抗原抗体间固有的结合力。
（3）亲水胶体转化为疏水胶体：抗体是球蛋白，多数抗原亦为蛋白质，溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。如果溶液pH偏高，形成水化层，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。此时，如再加入电解质，如0.85%NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物，发生凝集或沉淀。抗原抗体结合形成复合物的原理主要是蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。
（二）抗原抗体反应特点
抗原与抗体的结合具有高度特异性，其中抗原的特异性取决于抗原表位的化学基团性质、数目、及其立体构型，而抗体的特异性取决于V区的抗原结合部位空间构象，应与抗原表位精确互补吻合。抗原表位与抗体超变区结合的特异性如：外-斐试验—变形杆菌OX。
只有当抗原抗体分子比例合适时抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多，称为抗原抗体反应的等价带；若抗原或抗体极度过剩则无沉淀形成，称为带现象；抗体过量时，称为前带；抗原过剩时，称为后带。
抗原与抗体结合仅是非共价键结合，稳定但可逆。复合物在一定条件下可发生解离，动态平衡过程。
抗原抗体反应可分为2个阶段：
（1）第一阶段为特异性结合阶段，反应取决于抗原表位与相应抗体的抗原结合部位的空间构象互补吻合，与外界因素无关。反应进行较快，大多在几秒钟至数分钟内即可完成，但无肉眼可见反应出现。
（2）第二阶段为可见反应阶段，在抗原与抗体特异结合的基础上，受环境中电解质、温度、pH、补体等因素的参与和影响，表现为凝集、沉淀、补体结合、细胞溶解等可见反应。此阶段较长，历时数分钟、数小时乃至数天。但若为单价抗体或半抗原则仍不出现可见反应。2个阶段并无严格界限，往往第一阶段反应还未完全完成，即开始第2阶段反应。
（三）影响抗原抗体反应的因素
（1）抗体：抗体类型、特异性、亲和力和浓度都影响抗体抗原反应，等价带的宽窄影响抗原抗体复合物的形成，单克隆*抗体不适用于沉淀反应。抗体结合价：一个Ig的抗原结合部位的数目即是抗体的结合价。IgG为2价，SIgA为4价，IgM理论结合价是10价。 抗体一般是双价的。
（2）抗原：抗原的分子量、理化性状、抗原表位的种类及数目均可影响反应结果。颗粒性抗原出现凝集反应，可溶性抗原出现沉淀反应，单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。抗原结合价：一个抗原分子所携带的功能性抗原表位的数目即是该抗原的结合价。半抗原是1价，天然抗原是多价。由于天然抗原一般是大分子，由多种多个抗原表位组成，可以和多个抗原分子交联形成大分子免疫复合物。
（1）电解质：电解质可以中和胶体粒子表面所带电荷，进一步使疏水粒子相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物，发生凝集或沉淀。为了促成沉淀物或凝集物的形成，常用0.85%NaCl或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。
（2）酸碱度：当pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会发生非特异性凝集或沉淀。抗原抗体反应一般在pH6～9进行，有补体参与的反应最适pH为7.2～7.4。
（3）温度：常用的抗原抗体反应温度为37℃。在一定范围内，温度升高抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速，此外适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。
十、免疫原和抗血清的制备
颗粒性抗原如各种细胞、细菌、寄生虫等。一般情况下细胞抗原（如绵羊红细胞）经生理盐水或其它溶液洗净，配制一定浓度即可。颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。 细菌抗原（如鞭毛抗原、菌体抗原、毒素抗原）；多用固体培养基培养，经生理盐水集菌后处理，如菌体抗原加温100℃，2～2.5h去除，而鞭毛抗原需用0.3%～0.5%甲醛处理。
提取细胞的可溶性抗原，需将细胞破碎。根据细胞类型不同，选择破碎的方法也有一定的差异，几种常用的细胞破碎方法：酶处理法、冻融法、超声破碎法、表面活性剂处理法。
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为可溶性抗原。免疫前需纯化和鉴定。可溶性抗原的纯化方法有：超速离心分离法，选择沉淀法，凝胶过滤法，离子交换层析法，亲和层析法等。
纯化抗原的鉴定方法常有：①物理分析法：如鉴定抗原分子量和纯度可用聚丙烯酰胺凝胶电泳法等；②化学分析法：如可用酚试剂法测定抗原蛋白质含量；③免疫学方法：如可用琼脂扩散法、免疫电泳法等鉴定抗原的免疫学性质、含量等。
3、半抗原性免疫原的制备
（1）某物质在独立存在时只具有反应原性而无免疫原性，称为半抗原。如多肽、多数的多糖、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些小分子量的药物等。
（2）半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。
（3）载体的选择：适用于做半抗原载体的有：①蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等，以牛血清白蛋白（ELISA板包被后最常用的封闭物质）最常用。②多肽类聚合物：常用多聚赖氨酸。③大分子聚合物和某些颗粒：多用活性炭。
免疫佐剂：与抗原同时或预先注射于机体，起增强机体对抗原免疫应答或改变免疫应答类型的辅助物质。
（1）具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。
（2）不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸等。
（3）应用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。福氏佐剂：分完全福氏佐剂（石蜡油、羊毛脂和卡介苗混合而成）、不完全福氏佐剂（石蜡油和羊毛脂混合而成）两种，不含免疫原性物质。福氏完全佐剂可提高佐剂效能，但注射后易产生局部持久性溃疡和肉芽肿。
2、免疫佐剂的作用 （不能改变抗原的特异性）
（1）把无抗原性的物质转变为有效的抗原，增强免疫原性。
（2）增强循环抗体的水平或产生更有效的保护性免疫，增强抗体的滴度；
（3）改变所产生的循环抗体的类型；
（4）增强细胞介导的超敏反应的能力，引起或增强迟发型超敏反应；
（5）保护抗原（特别是DNA，RNA）不受体内酶的分解。
3、免疫佐剂与抗原的比例为1:1。
（1）免疫动物必须适龄、健壮、体重达标、无病原微生物感染。
（2）抗原与免疫动物的种属差异越远越好。
（3）根据抗原的免疫原性选择，针对不同性质的免疫原选择相应的动物。如蛋白质抗原大部分动物皆适合。
（4）制备H血清用马，制备R血清用兔。
根据免疫目的的要求、抗原性质、佐剂种类来制定免疫方案。可采用全量免疫法、微量免疫法、或混合免疫法。免疫接种途径通常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、淋巴结等接种途径，对抗原的吸收速度为：静脉＝脾脏＝淋巴结＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内。若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。免疫接种剂量则应根据抗原分子量大小、免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间决定。
第一次与第二次免疫的时间间隔一般以10～20天最佳，二次以后间隔时间一般为7～10天。
有颈动脉放血法、心脏采血法、静脉多次采血法。分离血清采用室温自然凝固、静置4℃冰箱待血清析出后收取。小鼠取血通常用摘除眼球或断尾法，应选择在末次免疫后5～7天及时采血。
（四）抗血清的鉴定和保存
可用试管凝集试验、琼脂扩散试验、ELISA和放射免疫分析等测定。目前最常用的是放射免疫法和琼脂双向扩散。
最常见的纯化方式是提取特异性IgG或单价特异性抗血清。特异性IgG抗血清制备：首先用硫酸铵或硫酸钠盐析法粗提丙种球蛋白，再进一步纯化。粗提法提取γ球蛋白：大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法，硫酸铵盐析须经多次沉淀，经三次提取后的γ球蛋白大多属于IgG。亲和层析法：交叉杂抗原与琼脂糖珠4B交联制成层析柱（将交叉抗原交联到琼脂糖珠4B上）。
4℃保存，可保存3个月～半年；-70～-20℃保存可保存2～3年左右，但需防止反复冻融；真空冰冻干燥保存，可保存4～5年。
（五）单克隆抗体的制备
由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一（纯度高、有效抗体含量高）、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易，可用于诊断和治疗。
天然的抗原注入机体后，多产生多克隆抗体（PoAb）。天然抗原常有多种不同抗原表位，因此可刺激体内多个B细胞克隆活化并产生针对多种不同抗原表位的抗体、其混合物即为多克隆抗体，血清及组织液中的抗体就是多克隆抗体。
细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以称为HAT培养基。B细胞杂交瘤可在HAT选择培养基中生长、繁殖和传代。
3、动物免疫制备抗体，最常用的注射器官是小鼠腹腔。
4、克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞应及时冻存，最好保存在-196℃液氮中。
5、用单克隆抗体测定细胞膜上的分化抗原，可将淋巴细胞分成不同的亚群。
6、杂交瘤细胞产生抗体的遗传信息来自脾细胞。
7、单克隆抗体的特点是高特异性、高度的均一性、具有单一的生物学功能、弱凝集反应和不呈现沉淀反应。
制备单克隆抗体用B淋巴细胞杂交瘤技术，制备淋巴因子用T淋巴细胞杂交瘤技术。组合抗体库技术可以使抗体的轻、重链可变区随机组合，产生新的轻重链配对。
细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合，抗体可将颗粒性抗原交叉连接，出现凝集，称直接凝集反应。参加凝集反应的抗原称凝集原，抗体称凝集素。
1、玻片凝集试验：一般用来鉴定菌种或分型；也用于人类ABO血型的测定。
2、试管凝集反应是定性和半定量试验，用于肥达反应、外斐反应等。
1、间接凝集反应的概念
间接凝集试验又称被动凝集试验，是将可溶性抗原或抗体吸附或者偶联在一种与免疫无关的颗粒上，使之成为致敏颗粒，与相应的抗体或者抗原特异性结合，出现凝集现象。凝集为阳性，不凝集反之。
2、间接凝集反应的分类
间接凝集反应可分为正向间接凝集反应、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应和协同凝集反应4类。
（1）正向间接凝集反应：诊断试剂为标准抗原致敏颗粒，如果被检样品与抗原致敏颗粒混合后出现凝集现象，说明标本中含有对应抗体，此为凝集阳性反应。
（2）反向间接凝集反应：诊断试剂为诊断抗体致敏颗粒，如果被检样品与抗体致敏颗粒混合后，凝集阳性反应说明标本中含有与诊断抗体对应的抗原。
（3）间接凝集抑制反应：诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。如果标本中存在相应原，则凝集反应被抑制，无凝集产生为阳性结果。
（4）反向间接凝集抑制试验：是用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂，以检测标本中的抗体。如果标本中存在相应抗体，则凝集反应被抑制，无凝集产生为阳性结果。
（5）协同凝集反应：诊断试剂为诊断抗体致敏的SPA+、金黄色葡萄球菌。大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上有葡萄球菌的A蛋白（SPA），SPA具有能与特异性抗体IgG的Fc段结合（IgG3除外）的特性。当SPA与IgG-Fc结合后，IgG-Fab与相应抗原分子特异性结合使葡萄球菌凝集，凝集阳性反应说明标本中含有与诊断抗体对应的可溶性抗原。
沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象。沉淀反应属于体外抗原抗体反应。
（1）参加沉淀反应的抗原可以是蛋白质、多糖、血清、毒素等，但其物理性状必须是可溶性的。
（2）沉淀反应分两个阶段
①第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒完成，出现可溶性小复合物，肉眼不可见；
②第二阶段为形成可见的免疫复合物，如沉淀线、沉淀环。
凝胶内沉淀试验是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。
将已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔加入抗原，在合适的温度和一点时间后，孔内抗原环装扩散形成浓度梯度，在抗原抗体比例合适处形成沉淀环。沉淀环的直径或面积的大小与抗原量呈正相关。本方法检查灵敏度低，检测时间长达48～72小时。最常用于抗原定量。
单向扩散试验检测时的注意点：抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强；每次测定都必须作标准曲线；每次测定必须用质控血清做质控；
免疫琼脂双向扩散是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两者相遇即发生待异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。观察沉淀线的位置、形状和对比关系，可以对抗原或者抗体进行定性分析：
（1）无沉淀线产生，说明无相对应的抗原（抗体）或抗原（抗体）过量；
（2）两条沉淀线互相吻合相连——两个抗原性质完全相同；
（3）两条沉淀线交叉——表明两个抗原完全不同；
（4）两条沉淀线相切——表明两个抗原部分相同；
（5）沉淀线弯向分子量大的一方；
（6）沉淀线靠近浓度低的一方。
定时散射比浊法与速率散射比浊法的最大区别在于采集的测定信号不同。
免疫比浊法的前体条件是要保证抗体过量。
1、免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。
2、免疫电泳的影响因素：
（1）抗原与抗体特性；
（2）电场因素：①电场强度；②溶液pH值；③离子强度；④电渗（指在电场中水对固相介质的相对移动不影响蛋白质的分离，但影响其远点位置）。
3、最常用于M蛋白的鉴定。
1、实质上是双向免疫扩散试验与电泳相结合在直流电场中的定向加速免疫扩散技术。
2、实验是在琼脂板上打两排孔，两侧分别加待测抗原和相应抗体，在两者之间或者抗体测形成沉淀线。
常用于抗原或抗体的性质、效价和纯度测定。
1、火箭电泳是免疫单向扩散与电泳相结合的一种定向加速的单向扩散试验。
2、试验是将抗体混于琼脂中，电泳使抗原由负极向正极移动，并随抗原浓度的减少，抗原抗体复合物形成的沉淀线也越来越窄，最后形成一个火箭状的不溶性复合物沉淀峰。
3、琼脂中抗体浓度不变时，沉淀峰的高度与抗原量呈正比。根据标准曲线可计算出待测样品的含量，反向火箭电泳（固定抗原浓度）可测抗体的含量。
1、免疫电泳是区带电泳和免疫双向扩散相结合的技术。
2、实验是在琼脂中央纵向挖槽，将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳。然后在槽内加入抗血清，进行双向扩散。
1、实质是将凝胶电泳的高分辨率与免疫化学方法的高灵敏度结合起来的电泳技术。（区带电泳+沉淀反应+化学染色）。
2、实验原理是先将待检样品在凝胶板上作区带电泳，将蛋白质分离成不同区带，然后在其上覆盖抗血清，当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合，便形成抗原抗体复合物而沉淀。然后用氨基黑，参考泳道和抗原抗体沉淀区带被着色。
3、最常用于M蛋白的鉴定，也用于尿液中本周蛋白的检测及κ/λ分型。
1、带电荷的分子在具有渗透能力的介质上迁移。
2、常用电泳介质：醋酸纤维薄膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶。其中聚丙烯酰胺凝胶的分辨率最高。
1、免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。
2、免疫电泳的影响因素：
（1）抗原与抗体特性；
（2）电场因素：①电场强度；②溶液pH值；③离子强度；④电渗（指在电场中水对固相介质的相对移动不影响蛋白质的分离，但影响其远点位置）。
3、最常用于M蛋白的鉴定。
1、实质上是双向免疫扩散试验与电泳相结合在直流电场中的定向加速免疫扩散技术。
2、实验是在琼脂板上打两排孔，两侧分别加待测抗原和相应抗体，在两者之间或者抗体测形成沉淀线。
常用于抗原或抗体的性质、效价和纯度测定。
1、火箭电泳是免疫单向扩散与电泳相结合的一种定向加速的单向扩散试验。
2、试验是将抗体混于琼脂中，电泳使抗原由负极向正极移动，并随抗原浓度的减少，抗原抗体复合物形成的沉淀线也越来越窄，最后形成一个火箭状的不溶性复合物沉淀峰。
3、琼脂中抗体浓度不变时，沉淀峰的高度与抗原量呈正比。根据标准曲线可计算出待测样品的含量，反向火箭电泳（固定抗原浓度）可测抗体的含量。
1、免疫电泳是区带电泳和免疫双向扩散相结合的技术。
2、实验是在琼脂中央纵向挖槽，将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳。然后在槽内加入抗血清，进行双向扩散。
1、实质是将凝胶电泳的高分辨率与免疫化学方法的高灵敏度结合起来的电泳技术。（区带电泳+沉淀反应+化学染色）。
2、实验原理是先将待检样品在凝胶板上作区带电泳，将蛋白质分离成不同区带，然后在其上覆盖抗血清，当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合，便形成抗原抗体复合物而沉淀。然后用氨基黑，参考泳道和抗原抗体沉淀区带被着色。
3、最常用于M蛋白的鉴定，也用于尿液中本周蛋白的检测及κ/λ分型。
1、带电荷的分子在具有渗透能力的介质上迁移。
2、常用电泳介质：醋酸纤维薄膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶。其中聚丙烯酰胺凝胶的分辨率最高。
十四、免疫细胞分离检测技术
1、外周血单个核细胞（PBMC）分离
（1）原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，血小板在1.030～1.035之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，因而可以用一种比重介于1.075～1.092之间近于等渗的溶液作密度梯度离心法分离。
（1）试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll种。
①Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层和血小板层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。
②Percoll分层液法：是连续密度梯度离心分离法，由上到下依次为：死细胞层和血小板层、血浆层、富含单核细胞组分层、富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。Percoll分层液法是纯化分离单核细胞和淋巴细胞的一种较好方法。
（1）纯淋巴细胞群的采集：从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。主要方法有：①黏附贴壁法；②吸附柱过滤法；③磁铁吸引法。
（2）淋巴细胞亚群的分离常用的方法：①E花环沉降法；②尼龙毛柱分离法；③亲和板结合分离法；④磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法。
3、淋巴细胞的保存及活力测定
（1）淋巴细胞保存技术：①短期保存：用适量含10～20%灭活小牛血清的Hanks或其他培养液稀释重悬。②长期保存：液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。
（2）淋巴细胞活力测定：最简便常用的为台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色。但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。
1、T细胞表面有特异性绵羊红细胞（E）受体，当人的T细胞与绵羊红细胞悬液按一定比例混合后，T细胞表面的E受体可与绵羊红细胞结合形成玫瑰花样的花环，称为活性E花环。检测活性E花环形成细胞可反映受检者的细胞免疫水平。
2、E玫瑰花环形成率代表T细胞百分率。
3、E玫瑰花环试验可以检测T细胞数量。
4、利用E花环沉降法可分离B细胞和T细胞。
5、溶血空斑形成试验（PFC）中，每一个空斑表示一个抗体形成细胞，用来检测B细胞功能。
6、硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验用以检测中性粒细胞的胞内杀菌能力。
7、炭粒廓清试验判断巨噬细胞的吞噬功能。
十五、临床常用免疫技术
1、概念：放射免疫技术分析是利用放射性核素作为示踪物来检测反应体系中的抗原抗体复合物的标记免疫技术。放射免疫技术的基本类型有放射免疫分析（RIA）、免疫放射分析（IRMA）和放射受体（或配基）分析（RRA）。
2、放射免疫分析优缺点：①优点：灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量小，可以用于极微量（ng甚至pg水平）抗原的检测。②缺点：对工作人员和环境易造成危害或污染。
3、放射免疫分析常用的放射性核素有：①产生γ射线的I125、I131和Cr51等，其中最常用的是I125；②产生β射线的H3、C14和P32等，其中最常用的是H3。
4、放射性核素使用最广泛的是I125。其优点有：①I125的化学性质较活泼，容易用较简便的方法制备标记物；②其衰变过程不产生电离辐射强的β射线，对标记多肽、蛋白抗原分子的免疫活性影响小；③I125释放的γ射线测量方法简便，易于推广应用；④I125的半衰期长、核素丰度及计数率较I131更为适用。
5、放射免疫分析（RIA）
（1）原理：标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对有限量特异性抗体（Ab）竞争性结合反应，以测定待测抗原的性质和含量。 Ag*与Ag的免疫活性完全相同，对Ab具有同样的亲和力。
（2）RIA测定包括3个步骤：：①待测标本中未标记抗原，标记抗原和抗体进行竞争抑制反应；②将B和F的分离（分离方法有第二抗体法、聚乙二醇沉淀法、活性炭吸附法等）。③对B进行放射性强度的测定。
（3）Ag的量与B（标记抗原抗体复合物）成反比，与F（游离的Ag*）成正比。B/F或B/B+F值与待测抗原浓度呈反比。
6、免疫放射分析（IRMA）
（1）原理：用过量放射性核素标记抗体（Ab）与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应。再加入固相标准抗原吸附除去游离标记标本，离心沉淀后，通过测定上清液（含待测Ag-Ab）的放射性强度与待测抗原成正比，可推算出样品中待测抗原含量。
7、IRMA与RIA的异同点：①RIA使用标记抗原（限量），IRMA使用标记抗体（过量）；②RIA中抗体结合标记抗原的量与被测抗原浓度成反比关系，而IRMA呈正比；③RIA需对B、F分别作放射强度测定，IRMA只测定上清液的放射强度； ④IRMA为非竞争结合，RIA为竞争抑制。⑤RIA的反应速度较慢，IRMA较快。
8、放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高，常用于测定各种激素（如甲状腺素）、微量蛋白质、肿瘤标志物（AFP、CEA、CA125、CA199）和药物（巴比妥、氨丙嗪）。但核素的放射性对人体有一定的危害
性。核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，有诸多不便之处，近年来有被取代的趋势。
（1）异硫氰酸荧光素（FITC）应用最广，最大吸收波长为490～495nm，最大反射光波长为520～530nm，呈明亮的黄绿色荧光。
（2）四乙基罗丹明（RB200）：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
（3）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。
（4）藻红蛋白（PE）：呈红色荧光，最大吸收波长为546/565nm最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。
（5）镧系螯合物：某些三价稀土镧系元素，以Eu3+应用最广。Eu3+激发光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。
2、荧光技术中有关的概念和参数 （了解内容）
（1）发射光谱：即荧光分子的荧光光谱，值用固定波长的激发光激发样品时，检测仪器用不同检测光波长检测到的样品发射荧光的相对强度。
（2）激发光谱：即荧光分子的吸收光谱，指用不同波长的激发光激发样品时，检测仪器用固定检测光波长检测到的相应荧光发射强度。
（3）荧光效率：是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光。
（4）荧光寿命：指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。
（5）荧光的猝灭：指在受到激发光较长时间照射后，荧光物质的荧光辐射能力发生减弱的现象。
3、免疫荧光技术的不足之处在于：有非特异性荧光的干扰、荧光会淬灭。
4、影响荧光强度的因素：
（1）温度：温度≥20℃时，荧光效率会降低。
（2）荧光素的浓度：荧光物质浓度太高会发生自熄灭（淬灭）现象。
（3）溶剂：增大溶剂的极性会使荧光强度减弱。
5、间接荧光法灵敏度高，为目前公认的最有效的检测抗核抗体（ANA）的方法，且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。常用于检测血清中自身抗体和多种病原体抗体。
6、直接荧光法的特点是特异性强而灵敏度低。
7、荧光素与蛋白质结合比率（F/P）值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之越少。用于固定标本的荧光抗体以F/P=1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P=2.4为宜。
酶免疫技术是利用酶标记抗体（或抗原）与检测标本中的相应抗原（或抗体）特异性结合，利用酶催化底物反应的生物放大作用显示免疫复合物的存在，提高检测抗原-抗体复合物敏感性的一种免疫标记技术。酶免疫技术包括酶免疫组化技术和酶免疫测定。
（1）辣根过氧化酶（HRP）：是ELISA和酶免疫组化技术中最常用的酶。等电点pH为5.5～9.0，最常用的底物为四甲基联苯胺（TMB），TMB经过HRP作用后呈蓝色，用H2SO4终止后变为黄色，在450nm处有最大吸收峰。
（2）碱性磷酸酶（AP）：最适合pH为8.0。常用的底物是对硝基苯磷酸酯，其反应产物为黄色对硝基酚，最大吸收波长为405nm。
酶标记的抗体或抗原称为酶结合物，制备抗体酶结合物的方法常用戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
（1）戊二醛交联法：戊二醛可以使与蛋白质的氨基偶联，方法有一步法和二步法。
（2）过碘酸盐氧化法：此法只用于HRP与蛋白交联。
（3）标记抗体鉴定和最佳工作浓度选择通常采用棋盘滴定法进行滴定。
（1）酶免疫技术的主要试剂：为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。
（2）最常用的固相载体：是聚苯乙烯，其有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。在测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。最常用的载体为微量反应板，如ELISA板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。
（3）良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。
（1）概念：将抗原或抗体固相化的过程称为包被，而被固相化的抗原或抗体称为免疫吸附剂。
（2）封闭：为避免由于免疫吸附剂（抗原或抗体）浓度过低而不能完全覆盖固相载体表面，可能使其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也吸附于固相载体表面，产生非特异性显色而导致本底偏高，应在包被后再用1%～5%牛血清清蛋白包被一次，以消除这种干扰，这一过程称为封闭。
免疫组织化学技术是借助可检测的标记抗体（或抗原），在组织细胞原位进行特异性抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测。
酶免疫测定用于液体标本中抗原或抗体的测定。根据抗原抗体反应后是否需要分离结合酶标记物与游离酶标记物分为均相和异相法两类。
①均相酶免疫测定：均相酶免疫测定属于竞争结合分析方法，其基本原理：将标准半抗原与酶结合成酶标半抗原，半抗原与酶活性均不变。当酶标半抗原与相应抗体特异结合后，由于半抗原与抗体接触太紧密，使抗体分子在酶活性中心形成空间位阻，阻隔酶与底物结合，标记酶的活性被抑制。当样品中的待测半抗原与标准半抗原同质时，待测半抗原与酶标半抗原竞争结合抗体，待测半抗原浓度越高，游离的酶标半抗原就越多，酶活性就越高，即反应后酶活性与标本中的半抗原量成正比。由于在抗原抗体反应后结合态标记酶失去活性，就不需要分离结合态酶（Ag-Ab-E）与游离态酶（Ab-E或Ag-E），直接测定游离态酶的活性变化，即可推算出标本中Ag含量。均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。
②异相酶免疫测定：异相法又根据反应介质的物理状态分为液相酶免疫测定和固相酶免疫测定（常用ELISA）。异相酶免疫测定原理：在抗原反应后，先分离结合酶标抗体（E-Ab），然后测定E-Ab-Ag或E-Ab中的酶活性，推算出标本中的抗原量。
7、酶联免疫吸附试验（ELISA）
（1）双抗体夹心法：未标记固相诊断抗体与待检抗原反应后，加酶标诊断抗体，反应后加底物显色。颜色深浅与待测抗原呈正相关。双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。
双位点一步法：应用针对同一抗原分子上的2个不同抗原决定基的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体，在测定时可同时加入标本和酶标抗体（两步并作一步）。显色反应后颜色深浅与待测抗原量呈正相关。但要注意，如果标本中抗原含量过高，会出现钩状效应，可能影响结果的准确性。
（3）间接法：固相已知标准抗原与待检抗体反应后加酶标羊抗人IgG抗体，反应后加底物显色。颜色深浅与待测抗体量呈正相关。是检测抗体最常用的方法。
（4）竞争法：可测定抗原或抗体，以抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。
（5）捕获法测IgM抗体：先将所有血清IgM固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。测定IgM抗体多用捕获法。
双抗体夹心法检测抗原A时，固相载体的包被物是未标记的抗A抗体。
酶免疫技术中的酶结合物是酶标记抗原或抗体。
双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、捕获法 待测孔（管）最后显示的颜色深浅与标本中的待测抗原或抗体呈正相关。
8、免疫印迹法在艾滋病病毒感染中作为确诊试验。
9、生物素-亲和素免疫放大技术
（1）生物素又称维生素H或辅酶R，分子量244.31，存在于蛋黄中。 生物素有I与II两个环状结构，I环为咪唑酮环，与亲和素结合；II环是吩噻环，其C2位上有一戊酸侧链，戊酸的羧基是与蛋白质分子结合的结构。
（2）每个亲和素分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子稳定结合，形成一种类似晶格的复合体，此为生物素-亲和素免疫放大作用的主要机制。亲和素（链霉亲和素）的与生物素咪唑酮环结合的活性基团都是色氨酸。亲和素（链霉亲和素）的标记几乎可与所有标记示踪物（HRP、荧光素、放射性核素、胶体金等）、抗原、抗体、酶、铁蛋白和荧光蛋白等结合。
（3）标记蛋白质氨基的活化生物素：N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）。
标记蛋白质醛基的活化生物素：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。
标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。
标记蛋白质核酸的活化生物素：光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。
十六、细胞因子测定及应用
1、细胞因子的共同特性：为糖蛋白；可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用；一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞可产生一种或几种相同的细胞因子。
（1）细胞因子：①IL-1：主要由巨噬细胞产生，有较强的致热源作用和局部免疫调节作用。②IL-2：主要由T细胞（CD4+）受抗原或丝裂原刺激后合成。IL-2可刺激T细胞生长，促进B细胞生长分化。
（2）干扰素：抗肿瘤、抗病毒、免疫调节。抗病毒活性测定法主要用于检测：干扰素（IFN）。
（3）肿瘤坏死因子（TNF）：抗肿瘤和免疫调节功能，对多种肿瘤细胞和病毒均有杀伤或抑制作用。
（4）造血生长因子：红细胞生成素（EPO）可刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落。
4、细胞因子测定的临床应用
可作为特定疾病诊断的辅助指标，用于评估机体的免疫状态、判断治疗及预后，作为临床治疗应用时的监测等。
十七、自身抗体的检测及应用
1、检测方法：常用间接免疫荧光法。
2、常见ANA荧光图形及意义：①均质型（H）多是由抗DNP抗体所引起，也可由核小体抗体（抗组蛋白抗体）和抗双链DNA抗体引起，主要见于活动期SLE、药物性狼疮。②斑点型：是由ENA抗体引起，高滴度的斑点型常见于MCTD；③周边型：主要由抗dsDNA的抗体所引起，主要见于SLE；④核仁型：主要见于硬皮病；⑤着丝点型：主要见于局限性硬皮病及CREST综合症；⑥核膜型：主要由抗核膜抗体引起。
（1）抗Sm抗体：是SLE的血清标志抗体。
（2）抗核RNP（nRNP）抗体：是诊断混合性结缔组织病（MCTD）的重要依据。
（3）抗SSA/Ro/抗SSB/La：是干燥综合症（SS）最常见的自身抗体。
（4）抗Jo-1抗体：最常见于多发性肌炎（PM）。
（5）抗Scl-70抗体：仅见于进行性系统性硬化病（PSS），是PSS的标志性抗体。
（6）抗乙酰胆碱受体（AchR）：AchR是重症肌无力患者的标志抗体。
（7）抗心磷脂抗体（ACLA）：ACLA抗体阳性常见于反复自然流产、SLE、RA等。
（8）抗线粒体抗体（AMA）：AMA阳性见于原发性胆汁性肝硬化。
5、抗双链DNA（dsDNA）抗体属ANA谱，是SLE的特征性标记抗体，是SLE活动期的重要标志。
6、类风湿性关节炎（RA）的自身抗体（变性IgG的自身抗体）以IgM为主，也就是说RF一般为IgM。
十八、MHC与HLA检测及应用
主要组织相容性复合体（MHC），主要组织相容性抗原（MHA），属于同种异型抗原。
1、MHC-I类分子：广泛表达于各种组织的有核细胞上，以淋巴细胞、白细胞表面的表达密度最高，成熟的红细胞、神经细胞及滋养层细胞不表达。
2、人类的MHC即HLA基因复合体位于人的第6对染色体的短臂上，传统上分为I、Ⅱ、Ⅲ三类基因。I类包括经典的HLA-A、B、C。Ⅱ类包括经典的HLA-DP、DQ、DR，其中DR是移植排斥的主要抗原。Ⅲ类由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。
3、MHC-Ⅱ类分子与免疫应答密切相关。
4、HLA-B27与强直性脊柱炎密切相关。
5、HLA的分型技术包括血清型分型法（微量淋巴细胞毒试验）和基因分型法。
1、超敏反应是指机体再次接触相同抗原时，发生的生理功能紊乱和（或）组织损伤。根据超敏反应发生机制和临床特点分为4型：I型（速发型超敏反应）、II型（细胞毒型超敏反应）、III型（免疫复合物型超敏反应）、IV型（迟发型超敏反应）。其中I型、II型和III型超敏反应主要由抗体介导，IV型超敏反应是由T细胞介导的。
（1）I型超敏反应又称速发型超敏反应，是变应原再次进入机体内后引发的超敏反应。特点为发生迅速，消退也迅速；由IgE抗体介导；主要病变在小动脉，毛细血管扩张，通透性增加，平滑肌收缩，不发生病理损伤，有明显个体差异和遗传倾向；补体不参与。
（2）常见的I型超敏反应性疾病常见的I型超敏反应性疾病包括过敏性休克、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性胃肠炎和荨麻疹。
（1）II型超敏反应又称细胞毒型超敏反应，是由IgG或IgM类抗体与靶细胞表面的抗原结合，在补体、巨噬细胞和NK细胞参与下，引起细胞溶解和组织损伤的超敏反应。
（2）常见的II型超敏反应性疾病：输血反应、新生儿溶血症、自身免疫性溶血性贫血、药物过敏性血细胞减少、Graves病、重症肌无力。
（1）Ⅲ型超敏反应又称免疫复合物型，是由可溶性免疫复合物沉积于毛细血管基底膜，通过激活补体以及在血小板、肥大细胞、嗜碱性粒细胞的参与下，引起充血水肿、中性粒细胞浸润、组织坏死为特征的炎症反应和组织损伤。
（2）常见的Ⅲ型超敏反应性疾病：局部免疫复合物病包括Arthus反应和类Arthus反应（局部反复注射胰岛素）等。全身免疫复合物病包括血清病、链球菌感染后肾小球肾炎、慢性免疫复合物病（SLE、RF）、过敏样休克反应等。
（1）IV型超敏反应又称迟发型超敏反应，是由效应T细胞再次接触相同抗原后引起以单个核细胞（巨噬细胞、淋巴细胞）浸润为主的炎症性病理损伤。
（2）IV型超敏反应特点：①发生慢，再次接触抗原后24～72h发生。 ②与抗体、补体无关，而与效应T细胞和吞噬细胞及其产生的细胞因子和细胞毒性介质有关。③无明显个体差异，在抗感染免疫清除抗原同时损伤组织。
（3）IV型超敏反应性疾病包括传染性迟发型超敏反应、接触性皮炎、移植排斥反应等。
肿瘤抗原是指细胞癌变过程中所表达的新生物或过量表达产物。根据肿瘤抗原特异性分为肿瘤特异性抗原（TSA）和肿瘤相关抗原（TAA）。
肿瘤特异性抗原是指仅表达于肿瘤细胞表面，而不存在于正常细胞的新抗原。①化学物质诱发的TSA特点是特异性高，抗原性较弱，常表现出明显的个体独特性。②病毒诱发的TSA具有较强的抗原性，瘤细胞表面的TSA多系病毒基因的表达产物，同一种病毒诱发的不同类型肿瘤可表达相同的抗原。
肿瘤相关性抗原是指非肿瘤细胞所特有，正常细胞也可表达的抗原物质，但在肿瘤发生时的机体可异常表达。①胚胎抗原是在胚胎发育阶段由胚胎组织产生的正常成分，在胚胎后期减少，出生后逐渐消失，或仅存留极微量。当细胞恶性变时，此类抗原可重新合成。最常见的：甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）。
②分化抗原。③其他TAA，如免疫抑制酸性蛋白、组织多肽抗原、铁蛋白、唾液酸等。
（二）肿瘤标志物的检测及临床意义
1、甲胎蛋白（AFP）：由卵黄囊和肝细胞合成，是胚胎期重要的血清成分，胎儿出生后，其浓度急剧下降。几个月至一年可降至正常水平。成人血清AFP含量升高可见于：①原发性肝细胞肝癌：有辅助诊断、早期诊断、鉴别诊断的意义，动态观察，AFP不高者不能排除原发性肝癌；②生殖系统胚胎瘤，如恶性畸胎瘤；③消化
道肿瘤肝转移；④妊娠，急、慢性肝炎，肝硬化一过性AFP升高。正常值＜20μg/L；AFP＞400μg/L时，对原发性肝细胞肝癌有较大的诊断价值。
2、癌胚抗原（CEA）：CEA是一种糖蛋白，作为成人结肠癌辅助诊断的重要项目
3、前列腺特异性抗原（PSA）：可用于前列腺癌的辅助诊断、疗效监测及预后判断。正常值0～4μg/L(EIA)；0～2.5μg/L(RIA)，常以＞4μg/L作为前列腺癌的诊断标准。总PSA（tPSA），游离PSA（fPSA）升高，tPSA/fPSA降低，高度提示前列腺癌的可能。PAS是器官特异性的癌抗原。
4、CA125：卵巢癌时可增高。
5、CA19-9：正常人＜37μg/L，是胰腺癌和结、直肠癌的标志物。胰腺癌患者85～95%为阳性。
6、CA15-3：30～50%乳腺癌患者明显增高，也是检测乳腺癌术后复发的最佳指标。
7、神经元特异性烯醇化酶（NSE）：是神经母细胞瘤和小细胞肺癌的标志物。
8、细胞角蛋白19（Cyfra21-1）：非小细胞肺癌患者最有价值的肿瘤标志物。
二十一、移植免疫及检测
（1）自体移植：如烧伤后植皮；
（2）同系移植：同系移植是遗传背景完全相同的个体间进行的细胞、组织或器官移植。如同卵双生子或同类系动物不同个体间的移植，移植后不发生排斥反应。；
（3）同种移植：同种异体移植；
（4）异种移植：移植后出现强烈排斥；
2、目前认为HLA-DR对移植排斥最为重要，而HLA-C在移植在移植免疫过程中没有明显作用。
3、排斥反应有两种基本类型：宿主抗移植物反应（HVGR）和移植物抗宿主反应（GVHR）。HVGR又可分为3种类型：超急排斥反应、急性排斥反应、慢性排斥反应。急性排斥反应在同种移植中最常见，多发生在移植后数周到1年内，病理特征为移植物实质和小血管壁上有以单个核细胞为主的细胞浸润、间质水肿与血管损害，后期在大动脉壁上有急性纤维素样炎症。
4、在器官缺乏的情况下，对受者施用免疫抑制剂，不再强调HLA配型，但ABO血型应该相容，预存的细胞毒抗体必须阴性。
5、计数供者外周单个核细胞中分泌IL-2的特异性T细胞比值。此比值≥1/100000，提示有可能发生
6、器官移植中最易发生移植排斥的是肝移植。
7、HLA-I类抗原血清学分型目前使用的是Terasaki改良的微量补体依赖的细胞毒试验，该方法被美国国立卫生研究院认可，成为国际通用的标准技术。
黏附分子分为5个家族，分别为：整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族、黏蛋白样家族、钙黏素家族。
