1. 实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂 PBS 平衡缓冲液、10％ FBS，IMDM 培养基。
2. 脱颈法处死 C57 小鼠，在 75％ 乙醇中浸泡 5 min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨（股骨和胫骨），浸泡于 PBS 溶液中。
3. 对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用 10％ FBS，IMDM 培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。
4. 细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于 37 ℃、5％ CO2 培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使 BMSCs 充分贴壁。
5. 培养 48 h 后换液，用预热的 PBS 缓冲液轻轻洗涤细胞 2 次，添加新鲜培养基，之后每隔 48 h 换液 1 次。原代培养 6～7 d 后细胞铺满 80％（图 1），可进行传代培养。
图 1：BMSCs 原代培养 6～7d (武汉云克隆诊断试剂研究所)
二、BMSCs 成脂诱导分化
待脂滴形成后进行油红 O 染色，PBS 缓冲液清洗 3 次，10％中性甲醛固定 20 min，再用 PBS 缓冲液清洗 2 次，油红 O 染液浸染 30 min，PBS 缓冲液清洗 2 次，苏木素染液浸染 1 min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。
成脂诱导分化过程中发现在诱导 5 d 时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴（图 2）。
三、BMSCs 成骨诱导分化
待矿化结节形成后，进行硝酸银染色。PBS 缓冲液清洗 3 次，10％ 中性甲醛固定 20 min，再用 PBS 缓冲液清洗 2 次，硝酸银染液浸染，于阳光下曝光 30 min，PBS 缓冲液清洗 2 次，倒置显微镜下观察拍照，可见矿化结节（图 4）。
