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1、.第一章至第五章一、 主要名词和概念：一1. 植物细胞全能性：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传物质,在一定条件下具有发育成为完整植物体的潜在能力。2. 脱分化：将已分化的不分裂的静止细胞放在培养基上培养后,细胞重新进去分裂状态,一个成熟细胞转变为分生状态的过程。3. 再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型,形成完整植株的过程。4. 器官发生途径：由外植体或愈伤组织诱导形成不定根或不定芽,再获得再生植株的方法5. 体细胞胚胎发生途径：在组织培养中起源于一个非合子细胞,经过胚胎发生和胚胎发育过程,形成具有双极性的胚状结构而发育成再生植株的途径

2、。6. 外植体：由活体植物体上切去下来的,用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。7.褐化现象：指在外植体诱导初分化或再分化过程中,自身组织从表面想培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。8. 看护培养：利用活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞,使其持续分裂和增殖的培养方法。9. 分批培养；把细胞分散在一定容积的培养基中培养,当培养物增值到一定量时,转接继代,建立起单细胞培养物。10. 连续培养：利用特质的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。11. 体细胞杂交：使分离出来的不同亲本的原生质体,在人工控制条件下,相互融合成一体,形

3、成杂种细胞,并进一步发育成杂种植株的技术。12. 雄核发育：在适宜的离体培养条件下,花粉小孢子的发育可偏离活体时的正常发育转向孢子体发育,经胚状体途径或器官发生途径形成完整植株。13. 雌核发育：以未受精子房或胚珠为外植体诱导单倍体的方法。14. 非整倍体：生物体的核内染色体数不是染色体基数整数倍,而发生个别染色体数目增减的生物体。15. 代换系：生物体的染色体被异源种属染色体所代换的品系。16. 易位系：某染色体的一个区段移接在非同源的另一个染色体上,具有发生染色体易位的品种。17. 附加系：将同种或异种的染色体导入受体中,叫做染色体附加。具有附加染色体的品种或品系叫附加系。18. 限制生长

4、保存：改变培养物生长的外界环境条件,限制离体保存材料的生长速度,使细胞生长至最小限度,但不死亡,从而达到延长继代培养的目的。19. 超低温保存：指在-80干冰温度至-196液氮温度甚至更低温度下保存生物材料。20. 体细胞无性系变异：将植物外植体在组织培养过程中,由于受到非生物因子的诱导发生变异,进而导致再生植株发生遗传变异的现象。二、 各章需掌握的主要内容1. 植物组织培养的类型有哪些？（1） 按照外植体类型：胚胎培养；器官培养；组织培养；细胞培养；原生质体培养（2） 按照培养基性质：固体培养；液体培养；（3） 按照培养方法： 精制培养；震荡培养；看护培养；饲喂培养；微室培养2.植株再生途径

5、主要有哪些？1经由成愈伤组织再生植株；2经由胚状体再生植株3.完整的植物组织培养实验室包括哪些部分？每一部分具有哪些功能？需要配备哪些仪器设备？自己能独立设计一个组织培养实验室。（1） 准备室,接种室,培养室（2） A：准备室配置培养基B：接种室采用无菌操作把材料接种到培养基上C：培养室在无菌和适宜的培养条件下进行培养。4.培养基的组成成分包括哪些？常用的植物激素和生长调节剂有哪些？需掌握化学名称和缩写符号。（1） 无机营养,有机营养,植物生长调节物质,糖类,水,琼脂（2） 生长素AUX,细胞分裂素CTK,赤霉素GA,脱落酸ABA5.茎尖培养的概念,以种苗繁殖为目的的茎尖培养包括哪些阶段？各阶

6、段对培养基条件有哪些要求？（1） 茎尖培养：把茎尖分生组织或包括此分生组织的茎尖分离进行无菌培养。（2） 无菌培养体系的建立芽的增殖中间繁殖体的增殖诱导生根试管苗的移植（3） 一般用MS培养基,之后根据发育方向配制培养基6.茎尖分生组织培养脱毒的原理是什么？影响脱毒效果的主要因素有哪些？病毒检测方法有哪些？其他脱毒方法还有哪些？（1） 感染病毒后,植株体内病毒的分布并不均匀,病毒的数量随植株部位及年龄而异,越靠近经顶端的区域,病毒感染率越低,生长点则几乎不含或含病毒很少。（2） 茎尖大小,取穗大小,取样时间,温度,持续时间,湿度和光照,前处理（3） 茎尖培养脱毒,微体嫁接脱毒,热处理脱毒（4）

7、 花器官等培养脱毒,珠心胚培养脱毒,合并使用热处理、茎尖培养或微茎尖嫁接脱毒7.种苗离体快繁中污染发生的原因主要有哪些？如何控制污染的发生？（1） A：材料内部灭菌处理不好B：正常灭菌条件下,内生菌能够存活C：来自寄生植物的污染D：培养基中材料超过一块相互污染（2） A：严格保证无菌操作的规范性,对培养基接种工具及接种室的严格消毒处理B：抗生素对细菌操作污染的防治C：真菌污染的防治D：常用防治污染方法8.原生质体分离中材料预处理方法有哪些？原生质体分离常用的酶类有哪些？原生质体如何分离和如何纯化？原生质体培养方法有哪些？（1） 低温处理；等渗溶液处理（2） 纤维素酶；半纤维素酶；果胶酶；崩溃酶

8、（3） A：分离：取材酶液配制酶解处理使酶解后的混合物穿过镍丝网B：纯化：离心法：利用比重原理,低速离心使原生质体沉于底部漂浮法：根据原生体与细胞碎片或细胞器比重的不同来分离原生质体界面法：采用两种不同密度的溶液,离心后使完整的原生质体处在两液相的界面（4） 平板培养法；看护培养法；微室培养法；液体浅层培养法；固-液体双层培养法9.原生质体融合方法有哪些？杂种细胞如何筛选？（1） A：化学诱导融合：盐类融合法；高pH高钙离子法；PEG法B：物理诱导融合：显微操作；离心震荡；激光照射；电融合（2） A：显微筛选技术：荧光染料标记,异硫氰酸荧光素发绿色荧光,碱性蕊香红荧 光素发红色荧光B：互补选择

9、法：利用两个亲本具有不同的遗传和生理特征,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法C：遗传标记筛选技术：基因互补筛选,利用隐性非等位基因互补筛选体细胞杂种10.离体小孢子发育途径有哪些？花粉分离方法有哪些？影响花药和花粉培养的主要因素有哪些？培养适宜时期是哪个时期？预处理方法有哪些？（1） 小孢子发育途径；营养细胞发育途径；生殖细胞发育途径；生殖细胞和营养细胞共同发育途径（2） 花粉漂浮自然释放法；人工挤压法；机械法（3） 供体植株基因型；小孢子发育时期；供体植株生理状态；预处理；培养及成分；培 养条件；接种密度和方向（4） 一般来说是小孢子发育到单核期左右第一次有丝分裂

10、前（5） 低温；热激；化学药剂；高渗透压；离心11.植物染色体加倍方法有哪些？化学方法诱导加倍常用试剂有哪些？影响加倍的因素包括哪些？多倍体鉴定方法有哪些？（1） 机械损伤；各种射线；高速离心；异常温度（2） 秋水仙素；氨磺灵；氟乐灵（3） 外植体；加倍剂类型；加倍剂浓度和处理时间；加倍剂的加入时间；助剂（4） A：形态学鉴定：各自独特的外观B：细胞学鉴定：染色体计数法C：生理生化鉴定：各种营养物质的含量、酶活性的测定D：分子生物学鉴定：分子原位杂交；分子标记12.限制生长保存方法有哪些？超低温保存的基本程序是什么？（1） 低温保存；干燥保存；生长抑制保存；高渗透压保存（2） 材料准备预处理冷

11、冻处理冷冻储存解冻再培养13.体细胞无性系变异的来源有哪些？无性系变异的发生与哪些因素有关？（1） A：外植体细胞中预先存在而在再生植株中表现出来的变异；B：组织培养过程中诱导产生的变异（2） A：染色体数目变异：整倍型变异；非整倍型变异B：体细胞染色体结构变异C：基因突变：核基因突变；细胞质基因突变D：转座因子的活化：转座因子的激活也是导致植物体细胞无性系高频率变异的主要原因之一。转座因子是指能在基因组中移动和修饰基因表达的DNA序列E：DNA甲基化状态的改变第六章 园艺植物的染色体工程1.园艺植物单倍体制备有哪些途径？答：1雄配子途径。采用花药培养或花粉培养,使小孢子改变原来的配子体发育途

12、径,转向孢子体发育途径,形成花粉胚或花粉愈伤组织,最后形成花粉植株,从中鉴定出单倍体植株并使之加倍成纯合二倍体。2雌配子途径。使园艺植物的胚囊中具有单倍性染色体构成的细胞,如未受精的子房或胚珠,在适当的条件下发育成单倍体植株。2.离体条件下,雄雌核发育各有哪些发育途径？答：雄核：1小孢子发育途径 2营养细胞发育途径 3生殖细胞发育途径 4生殖细胞和营养细胞共同发育途径。雌核：1助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体 2卵细胞、助细胞和反足细胞发育产生单倍体 3非正常发育的大孢子四分体产生单倍体。3.试述花药花粉培养的全过程及主要影响因素。答：基本程序应包括外植体选择、预处理、表面灭菌、接种、培养、

13、再生植株、单倍体植株鉴定、染色体加倍及获得纯合二倍体等步骤。影响因素：（1） 供体植株基因型。（2） 小孢子发育时期。一般来说单核期最适合。（3） 供体植株的生理状态。内源激素水平。（4） 预处理。（5） 培养基成分。（6） 培养条件。温度、光照。（7） 接种密度和方向。4.采用秋水仙素诱导园艺植物多倍体有哪些方法？答：1浸种法；2浸芽法；3滴苗法；4涂抹法；5套罩法；6毛细管法。5.创制园艺植物易位系、代换系和附加系分别有哪些方法？答：1易位系。包括常规方法诱导的辐射诱导和杂交诱导,和组织培养诱导中的胚拯救、细胞培养和原生质体培养。6.试述园艺植物单倍体、多倍体和非整倍体的主要鉴定方法和辅助

14、鉴定方法。答：1形态学鉴定。生长势,分枝数,叶片形状、大小、颜色,花蕾数量、形状,果实形状等都可以作为鉴定的依据。 2细胞学鉴定。染色体计数法、流式细胞分析法、核型分析法、气孔大小及保卫细胞叶绿体数目鉴定法、染色中心直径和异染色质数目法、花粉发育过程和花粉活力观察法、减数分裂行为观察法等。 3生理生化鉴定。通过对各种营养物质的含量、各种酶活性等方面的测定来对园艺植物染色体工程产物进行辅助鉴定。 4分子生物学鉴定。分子原位杂交,分子标记等。7.目前园艺植物染色体工程还存在着哪些问题？你认为应该如何解决？答：1单倍体。发展相对缓慢,至今仍有很多空白。发展方向：解决有些物种诱导率、可重复性差,很难实

15、际应用的问题；探明通过胚状体途径诱导雄核发育和雌核发育的适宜条件；找到克服花药培养中的白化现象,二倍体组织的生长对单倍体诱导的影响等问题的有效措施。 2多倍体。多倍体基因组发生了广泛的遗传变化,其基因平衡遭到破坏,存在一些缺陷,还有嵌合体问题。发展方向：找出园艺植物各自的适宜倍性,研究和解决多倍体的缺陷、嵌合体问题。 3非整数倍体。尚处在初级阶段,成果有限。发展方向：努力拓展园艺植物的研究范围,加强生物技术在园艺植物非整倍体制备中的应用。8.你怎么看待园艺植物染色体工程的前景？第七章 植物基因工程的基础知识与技术1.简述DNA双螺旋结构模式的要点及其与DNA生物学功能的关系。答：1生物的遗传信

16、息储存于DNA的核苷酸序列中； 2DNA双螺旋结构的稳定性主要由互补碱基对之间的氢键和碱基堆积力来维持； 3DNA双链经过盘绕压缩使松弛型DNA更为紧密,体积变得更小,在细胞的生命活动中更能保持DNA结构稳定。2.比较RNA和DNA在结构上的异同点。答：1基本单位不同,DNA为脱氧核苷酸、RNA为核糖核苷酸 2DNA的五碳糖为脱氧核糖,RNA的五碳糖为核糖 3DNA的碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶,RNA的为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶 4与DNA相比,RNA种类繁多,分子质量相对较小,通常以单链形式存在,RNA没有形成双螺旋,但也可以有局部的二级结构或三级结构。3.试述RNA的种类

17、及其生物学作用。答：1mRNA。直接指导蛋白质合成。 2tRNA。携带相应的氨基酸将其转运到核糖体上以供蛋白质合成。 3rRNA。蛋白质合成工厂核糖体的组成成分。4.基因工程常用的工具酶有哪些？答：1限制性内切酶。一类能够识别双链DNA分子总某一特定核苷酸序列,并能对核酸内部的磷酸二酯键进行切割的一种内切核酸酶。 2DNA连接酶。催化连接分离的DNA片段。 3DNA聚合酶。限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键DNA聚合酶探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶3切除末端磷酸基DNA外切酶3末端切除单核苷酸噬

18、菌体DNA外切酶5末端切除单核苷酸5.质粒载体、柯斯质粒载体、噬菌体载体和酵母人工染色体有何异同点？答：1质粒是能自主复制的双链环状DNA分子。2以噬菌体DNA为载体构成的重组DNA分子必须包装成完整病毒颗粒后才具有感染宿主的能力。经包装后重组DNA分子转化率提高100-1000倍。这类载体可以有效克隆15kb大小的外源基因。3科斯质粒是人工构建的,含有DNA 的粘性末端序列、质粒复制起始区及质粒一个抗药性标记的、兼具质粒与噬菌体DNA载体双重性质的特殊载体。4YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库,特别用来构建高等真核生物的基因组文库,并不用作常规的基因克隆。6.简述PCR技术的基本

19、原理。答：根据已知的待扩增的DNA片段序列,人工合成与该DNA两条链末端互补的两段寡核苷酸引物,在体外将DNA模板在酶促作用下进行扩增。PCR全过程可分为DNA模板变性、退火、延伸三个步骤,经若干循环所组成。首先高温作用使模板DNA变性解链,然后降低温度使引物与模板DNA链退火,在TaqDNA 聚合酶作用及dNTP底物存在下,引物链将沿着5 3方向延伸与模板互补的新链,新链则可作为下一次反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。通常单一拷贝的基因经2530循环可扩增100万200万拷贝。7.核酸分离主要有哪些方法？答：DNA的分离：CTAB法,SDS法；RNA的分离：1总RNA的提取 苯酚

20、法,异硫氰酸胍法及氯化锂沉淀法 2mRNA的分离 亲和层析的原理8.什么是分子杂交？分子杂交的主要技术有哪些？答：当带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起时,其特定的同源区段将会退火形成双链结构。可以通过观察杂种核酸分子的形成情况来判断不同来源DNA的亲缘关系。 Southern杂交：检测经限制性内切核酸酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。 Northern杂交：指将RNA变性及电泳分离后,并转移到固相支持物上,用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 Western印迹：蛋白质经过SDS-PAGE后,转移到膜上再与抗体探针结合进行检测的方法。 菌落原位

21、杂交：将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂解以释放DNA,将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。第八章1.什么是基因组文库？简述构建大片段基因组文库的主要步骤。答：园艺植物基因组文库：指的是来自园艺植物基因组全部DNA片段组成的基因文库。基因组DNA文库反映基因组的全部遗传信息。 构建大片段基因组文库的主要步骤：1,载体的制备包括载体DNA的分离,载体DNA的酶切,载体的脱磷酸化,载体DNA的纯化等步骤；2.大片段基因组DNA的制备；3,大片段DNA与克隆载体的连接；4,载体的遗传转化；5,克隆的挑取、验证；6,

22、文库的扩增、分装及保存。2.简述合成cDNA第二链的主要方法。答：自身引导合成法、置换合成法、同聚物引导法。3.简述图位克隆技术的原理及其优缺点。答：原理：首先找到一个与目标基因相连的DNA分子标记,然后通过染色体步移技术克隆分离出目标基因。优缺点：到目前为止,已有多个植物抗病基因通过该技术被分离,但是他们都具有较小的基因组、高密度的分子标记连锁图和较稳定成熟的转化系统。而对于基因组较大、重复序列较多的一些园艺植物,采用图位克隆法分离基因要步移大量的DNA片段,投资大,效率低。而且由于基因组中往往存在大量的重复序列,以及被用来步移的DNA大片段插入文库含有许多嵌套克隆或克隆后的重排现象等原因,

23、染色体步移十分困难。4.简述转座子标签法的基本步骤及其优缺点。答:利用异源转座子分离植物基因的一般操作步骤是：1,采取农杆菌介导等适当的转化方法把转座子导入目标之五,设法将转座子插入到目标基因内部或邻近位点,引起表型突变。2,通过表型筛选获得纯合突变株。3,构建纯合突变株的基因组文库。4,以转座子片段作为探针,从该基因组文库中筛选含转座子片段的克隆。5,以该克隆作为探针,筛选另一正常植株的核基因组文库,获得完整的正常目的基因。优缺点：利用转座子标签法可在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下分离植物基因,因此该技术已被广泛应用于植物功能基因的克隆研究,目前利用该法已经从多种植物中克隆了上百

24、个基因。但是该技术的前提条件是要筛选出转座子插入的突变体。在实际操作中,由于转座频率往往很低,因此需要筛选的突变体群体较大。而且,对于那些需在特定环境或特定发育阶段才有突变表型的基因,往往由于看不到明显的突变表型而被忽略。另外,由于基因的功能补偿等机制的作用,即使有些基因产生了插入突变,也可能看不到突变表型,因而不能运用该方法。5.差异表达基因分离法主要包括哪几种方法？各有何优缺点？答：mRNA差异显示、抑制性消减杂交SSH、代表性差异分析RDA、基因表达系列分析SAGE、cDNA-AFLP技术。mRNA差异显示：优点：简便、快速、RNA有量少、效率高。主要用于比较两种以上特定生理状态或不同发

25、育阶段的mRNA样品间基因表达的差异。缺点：1,假阳性特别高,增加了后续工作难度。2,由于PCR自身反应条件的敏感性,mRNA差异显示技术重复性较差。3,扩增片段较小,不能代表真正差异表达的基因,且上游的差异表达信息量的不到检测。4,对高拷贝数mRNA有较强的倾向性,不能用于反映低拷贝数的mRNA。抑制性消减杂交SSH:优点：1,假阳性率大大降低；2,目的序列富集程度较高,且丰度相对一致,确保了低丰度表达的cDNA有被检测的可能性极大地提高了检测效率；3,SSH灵敏度很高,重复性强。缺点：1,需要较多的其实材料的mRNA；2,更多地依赖于PCR技术,不能同时对数个材料进行比较；3,材料之间存在

26、的过多的差异及小片段缺失也不能有效地被检测。代表性差异分析RDA：优点：1,免去了物理方法分离单、双链的繁琐操作,通过接头修饰设计,借助PCR技术即能使目的片段得到有效扩增,减少假阳性。2,差减杂交在扩增后的cDNA群体之间进行,不再受供试的mRNA量的限制,拓宽了差减杂交的应用范围。3,一次实验课分离得到多个在T组和D组间差异表达基因的cDNA克隆,并能发现与表性相关的异常基因,检测基因的上调和下调表达。缺点：1,目的基因间丰度的差异在数轮差减杂交后的群体中保留了下来,在后续的筛选中,高丰度的差异基因容易得到,低丰度的差异基因不易检出,而低丰度的表达产物往往代表相对重要的基因。2,分离出来的

27、差异基因也可能与其表型无关,增加了后续鉴定的工作量。3,对样品T组和D组的纯度要求很高,如果两组材料间差别较大,则用此方法将达不到鉴定差别表达基因的目的。基因表达系列分析SAGE：优点：成本低效率高,能很灵敏的检测出那些低丰度表达的基因。缺点：1,只有那些基因库中存储标签所代表的基因才能被鉴定,对未搜索到匹配序列的标签鉴定存在困难,而且其效率依赖于现有的序列数据 。2,如果碱基序列发生错误,或者扩增效率发生变化,也会导致结果失真。3,该法虽然不需分别测定各cDNA的序列,但工作量仍然很大,且操作较为繁琐,需要使用测序仪,普通实验室无法做到。cDNA-AFLP技术：优点：它可以对生物体全部的mR

28、NA样品进行筛选,具有重复性高、假阳性率低的特点,其可靠性强,重复性可达95%。而且,在转录产物高度表达时,扩增条带的强度能准确反映基因间表达量的差别。缺点：操作过程繁琐,假阳性率有时也较高。6.简述基于同源序列的候选基因法分离目的基因的主要方法。答：1,根据已知基因的保守区设计引物,以待分离此基因的植物基因组DNA或cDNA为模板直接进行PCR扩增,对扩增产物测序并与已知基因进行序列比较,从而确定该基因是否为待分离基因。2,用用已知序列的基因制备探针,筛选待分离基因的植物核DNA或cDNA文库。再对阳性克隆进行测序,并与已知基因序列进行同源性比较,最后经转化鉴定是否为待分离的基因。7.简述R

29、ACE技术的基本原理及其优缺点。答： 原理：RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5和3末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR和单边PCR。3RACE的原理一加入oligo17和反转录酶对mRNA进行反转录得到cDNA；二以oligol7和一个35bp的接头为引物,其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物与少量第一链cDNA退火并延伸,产生互补的第二链cDNA。三利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。扩增的特异性取决于3amp的

30、碱基只与目的cDNA分子互补而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长碱基引起的错配。5RACE的原理5RACE与3 RACE略有不同。首先,引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次,在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤,即先用GSP-RT逆转录 mRNA获得第一链cDNA后, 用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5 端加poly尾,再用锚定引物合成第二链cDNA,接下来与3 RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物进行PCR扩增。全长基因的获得：1,对3RACE和5RACE的产物序列的重叠区域分析,经过拼接获得全长cDNA2,通过分析R

31、ACE产物的3和5端序列,重新设计合成相应引物,PCR扩增出全长cDNA优缺点；优点；操作速度快,节省时间,可在短期内获得全长的cDNA。只需极少量的起始反应物质,具有快速、简便、经济、实用性强等优点,还几乎不存在产生非特异产物的可能。缺点：利用RACE技术来获得全长基因并不容易,甚至经常会发生错误的扩增和克隆结果,尤其是对于丰度较低、长度较长的基因。8.简述基因芯片技术的原理及其优缺点。答：原理：将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地排列固定于支持物上,然后使其与待测的标记样品基因按剑姬配对原理进行杂交,再通过共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对每一探针上的荧

32、光信号做出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。优缺点：优点：具有高度的敏感性和特异性,有高信息量、快速、样品用量少、用途广泛等优点。缺点：基因芯片需要大量已知的、准确的DNA和cDNA片段的序列信息,而且,需要高密度芯片制作的精密机械系统和操作工艺及微弱的杂交信号检出装置,芯片的制作和使用成本均较高,所以尚难在一般的实验室中普及使用。第九章 园艺植物遗传转化载体的构建1.什么叫卸甲载体？常用的卸甲载体有几种类型？卸甲载体是无毒的Ti质粒载体,又称onc-载体。是指为了使野生型的Ti质粒成为基因转化的载体,必须切除T-DNA中onc基因,即解除其武装,构建成卸甲载体。常用的卸甲载体类型：pGV3

33、850载体、pGV2250载体和pTiB6S3-SE载体3种。2.Ti共整合转化载体系统的特点及构建策略是什么？特点：1.Ti共整合载体由两个质粒组成,其中一个是E.coli质粒中间载体,另一个是卸甲Ti质粒组成；2.农杆菌中两个质粒形成一个大的共整合载体,E.coli质粒进入到根癌农杆菌后,以同源重组的方式与Ti质粒整合在一起,形成共合体,相对分子质量较大；3.共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低；4.必须用Sounthern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测；5.构建是比较困难。Ti共整合转化载体构建策略：基于中间载体与受体Ti质粒重组序列的不同,共整合载体可分为以pBR

34、322序列为同源序列的转化载体系统和基于左边界内部同源区的转化载体系统,即SEV系统。1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略：中间载体导入农杆菌；中间载体与受体Ti质粒的同源重组； 共整合载体的选择2.SEV系统的构建： pTiB63S3-SE质粒作为卸甲载体；pMON200作为SEV中间载体；通过三亲杂交将中间载体pMON200或pCIT30导入农杆菌,形成SEV的共整合载体。3.Ti双元表达载体系统有什么特点？它对于共整合系统具有哪些优点？双元载体系统特点：1.具有RK2质粒的复制功能,可以在大肠杆菌和根癌农杆菌中复制,并且与Ti质粒是向容的；2.具有Ti质粒的左右两侧或右侧的

35、边缘区序列,使DNA可以转移到植物细胞; 3.边缘区序列内包含植物选择标记嵌合基因,用于转基因阳性株的初步筛选； 4.带有抗生素基因,可以作为细菌转化因子的选择记号。与共整合系统比较的优点：1.构建简单2.具有双复制位点3.接合频率更高4.在鉴定上更为容易。4.发根农杆菌Ri质粒有什么特点？它可否与Ti质粒在异源T-DNA与Vir区的情况下完成DNA的转移？特点：1.可以不经解除武装进行转化,并且转化产生的发根能够再生植株；2.发状根是一个单细胞克隆,可以避免嵌合体；3.Ri质粒可直接作为中间载体；4.Ri质粒和Ti质粒可以配合使用建立双元载体系统,拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围；5

36、.发根适合于进行离体培养。Ri质粒的T-DNA可以在Ti质粒Vir基因的诱导下进行T-DNA的转化。5.选择标记基因和报告基因的特点是什么？常用的选择基因和报告基因各有哪几种？选择标记基因特点：1.编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；2.基因较小,可构成嵌合基因；3.能在转化细胞中得到充分表达；4.检测容易,并能定量分析。列举：新霉素磷酸转移酶基因npt II、潮霉素磷酸转移酶基因hpt、二氢叶酸还原酶基因dhfr、草丁膦乙酰转移酶基因bar报告基因特点：1.其产物在原植物中不存在或本底很低,并对宿主植物细胞无毒性；2.表达产物应有适度的稳定性以利于检测；3.检测手段高度敏感,检测方法简单、灵

37、敏并可以定量；4.检测过程应不具有破坏性。列举：冠瘿碱合成酶基因、萤火虫荧光素基因、绿色荧光蛋白基因、花青素合成相关基因。6.园艺植物常用的遗传转化载体类型包括哪些？正以表达载体、反义表达载体、RNA干涉载体、基因打靶载体、启动子缺失载体和瞬时表达载体等。7.目的基因与载体的连接方法有哪些？1.插入灭活发；2.定向克隆法：1同聚物加尾法2衔接物连接法3DNA接头连接法。第十章 园艺植物遗传转化1.园艺植物遗传转化方法有哪些？各有哪些优缺点？一外援裸露DNA的转化：1化学诱导转化法2电穿孔转化法 3基因枪转化法4激光微束穿孔转化法5体内注射转化法6脂质体介导转化法二载体介导的DNA转化：1根癌农

38、杆菌介导的遗传转化2发根农杆菌介导的遗传转化三种质转化法：1植物原位真空渗入法2花粉管通道转化法3种子浸泡转化法2.什么叫选择标记基因和报告基因？试举例说明怎样使用。选择标记基因：是指在选择压下,编码产物能够使转化细胞、组织具有对抗生素或除草剂的抗性,而非转化细胞则不能在使用选择剂的条件下生长、发育和分化的基因。举例：在园艺植物遗传转化中,将npt II一同转化植物受体细胞,使转化体具有npt II表达产物而对卡那霉素具有抗性。报告基因：指其编码产物在受体细胞、组织或器官中具有表达活性,能够被快速地测定的一类特殊用途的基因。举例：依据萤火虫荧光素酶在镁离子、三磷酸腺苷和氧的作用下,催化6-羟基

39、喹啉物质生成氧化荧光素,同时放出光子,检测简便、灵敏。3.比较Southern杂交、Northern杂交和Western杂交的原理及鉴定目的。Southern杂交原理：指模板DNA经酶切、凝胶电泳分离、转膜等步骤后,再用标记的单链DNA探针杂交探测的一种技术,其理论基础是碱基互补配对原则。鉴定目的：进行核酸序列分析、重组子鉴定和检测外源基因整合及表达情况,还可清除操作过程中的DNA污染和转化中的质粒残留所引起的假阳性信号。Northern杂交原理：RNA样品经凝胶电泳、转膜、预杂交后,再用标记的探针与膜上的RNA杂交,以检验RNA样品中是否有与探针同源的序列,如果有杂交信号,表明整合到植物染色

40、体上的外源基因能正常表达。鉴定目的：研究转基因植株外源基因表达及调控。Western杂交原理：从植物中提取总蛋白或目的蛋白,将蛋白质样品进行SDS-PAGE,使蛋白质按大小分离,将分离的各种蛋白质条带原位印迹到固相膜上,然后加入特异抗体一抗,印迹上的目的蛋白抗原与一抗结合后,再加入到能与一抗专一结合的被标记的二抗,最后通过二抗上的标记化合物进行检测。鉴定目的：鉴定转基因植株是否能产生特异抗体。4.什么叫转基因沉默？怎样克服？转基因沉默：导入并整合进受体基因组中的外源基因在转化体的当代或其后代中出现表达受到抑制,甚至完全不表达的现象,称为转基因沉默。怎样克服：1.采用合适的转化方法2.使用信号肽

41、3.使用强启动子和诱导型启动子4.使用强终止子5.使用增强子6.使用植物偏爱的密码子7.使用基质结合区序列8.防止甲基化9.改造外源基因。5.试述基因靶向技术的原理、步骤及当前的应用概况。基因靶向技术原理：利用同源重组、点突变或随机突变、RNAi等途径使机体已知结构的特定基因失活或缺失。一同源重组进行基因打靶原理：应用同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因剔除的目的。步骤：1.构建含目的基因和标记基因的重组载体；2.受体细胞的制备；3.用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞内,实现同源重组；4.用选择培养基筛选转化细胞；5.转化体培养、筛选及利用表型变化研究目的基

42、因功能。二随机插入突变进行基因打靶原理：利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体,在目标细胞基因组中进行随机插入突变,建立一个携带随机插入突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因剔除细胞。步骤：1.构建含目的基因的T-DNA载体；2.农杆菌介导法转化植株；3.转基因植株的坚定；4.插入失活突变植株筛选；5.T-DNA插入位点基因的克隆。第十一章1.与传统育种技术相比较,应用基因工程技术进行园艺植物遗传改良有哪些优点？答：1可提高作物产量和改善作物的抗虫、抗病、抗除草剂等抗逆能力； 2改善园艺产品的营养价值和食用风味,如营养成分含量、风味品质、延长货架寿命和保存时间,以

43、及用食品工程菌生产食品添加剂和功能因子等。2.举例说明利用转基因技术可以改良蔬菜作物的哪些性状？答：1Li等在番茄中超量表达土豆多酚氧化酶基因PPO的cDNA,结果表明强烈抑制了细菌的生长,使感染叶片中细菌密度减少到原来的10%,极大地提高了番茄植株对于细菌性病害的抗性。 2脯氨酶合成酶基因P5CS在胡萝卜中表达使植物的耐盐能力得到了明显提高。 3Meyer等将玉米的DFR基因导入白色矮牵牛植株中,是二氢黄酮醇还原为花葵素,转化后的矮牵牛花色有白色变成砖红色。3.生物技术在园艺植物育种中的应用有哪些方面？答：1创造雄性核不育系 途径1.通过核酸酶基因的特异空间表达创造雄性不育系 2.利用胼胝质

44、酶提前降解胼胝质壁是雄性不育 3.利用反义基因获得植物雄性不育 4.改变激素含量与比例获得雄性不育植株 5.导入细胞质雄性不育的有关基因导致植物性性不育 6.通过共抑制及RNAi转基因沉默创造植物雄性不育 2基因工程雄性不育系的恢复与保持 途径1.利用引起雄性不育基因的抑制基因来恢复育性 2.通过化学调控恢复育性 3.利用定位重组系统来恢复不育植株的育性4.如何应用生物技术提高园艺植物的光合能力和固氮能力？答：1提高光合能力：A：C4光合途径关键酶基因的克隆和转化。将C4途径涉及到的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC、磷酸丙酮酸二激情酶PPDK和苹果酸酶的基因从C4植物中克隆出来并导入C3植物。如

45、把玉米的PPDK基因导入马铃薯中,PPDK活性比对照高5.4倍。 B：果糖-1,6-二磷酸酶FBPase基因。将土豆叶绿体中的FBPase基因转化到土豆块茎的造粉体中,有着更高的活性,合成了更多的淀粉。 2提高固氮能力：向不能或固氮能力差的微生物中导入强的固氮基因。将克氏肺炎杆菌固氮基因nif导入不能固氮的植物或微生物中,以获得固氮植物或固氮微生物。把带有固氮基因的智力PRD1从大肠杆菌K12jc5564导入无固氮能力的水稻根系菌4502Y中,表现出较强的固氮能力。5.抗虫转基因园艺植物的获得有哪些途径？答：将抗虫基因导入植株中。 抗虫基因来源有植物、动物、昆虫、真菌、细菌和病毒。第十二章1.

46、植物研究中常用的遗传标记有哪几类？又有何优缺点？优点缺点形态标记简单直观,容易观察可利用的形态标记较少；许多标记为隐性；生育后期磁能观察到；受环境影响大；与不良现状连锁细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点,实现基因的染色体定位筛选和创造花费大量人力物力；难以保存或遗传稳定；常伴随有害效应,难观测鉴定；标记数目有限生化标记多态性高；受环境影响少；表现共显性；可期鉴定；所需材料少标记数目有限；蛋白质电泳分辨率有限,不能检测所有突变；每种同工酶标记都要特定显色方法；某些酶活性具有组织或发育特异性分子标记多态性高；表现稳定；许多分子标记为共显性；表现中性,不影响表达,无必然连锁；DNA变异广泛存

47、在2.分子标记产生的分子基础是什么？答：1DNA序列酶切位点的碱基发生突变,导致酶切位点消失、酶切产物减少。 2DNA序列酶切位点之间缺失或插入一段核苷酸序列,或是酶切位点之间的串联重复单元数目发生了改变,倒是酶切产物片段长度改变。 3单核苷酸突变,即单碱基转换或颠换。3.园艺植物常用的分子标记有哪些？产生的原理是什么？答：（1） RFLP标记：基于Southern杂交。RFLP标记是用限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群体的DNA,然后通过电泳和Southern杂交技术在酶切后形成的DNA片段中发现这种不同。根据含有与杂交探针同原序列的酶切片段的长度来检测DNA序列。（2） 小卫星标记：基于

48、Southern杂交。与RFLP标记原理大致相同,只对限制性内切核酸酶和杂交探针有特殊要求。（3） RAPD标记：基于PCR扩增。RAPD标记的操作步骤与常规PCR基本相似,只是引物不同。常规PCR使用双引物,通常1830bp,RAPD标记使用单引物,通常为10 bp的随机序列。（4） SSR标记：基于PCR扩增。SSR标记就是根据简单重复序列外两翼的特定序列设计引物,用来扩增重复序列本身,由于重复的长度变化极大,所以会得到不同长度的片段。如果扩增出来的某个片段与某个特定性状存在对应关系,则该片段为该性状的SSR标记。（5） ISSR标记：基于PCR扩增。设计出各种能与SSR序列结合的PCR引

49、物,这些引物的3端或5端加上24个随机核苷酸,通过PCR反应,对两个相距较近,方向相反的重复序列之间的DNA序列进行扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨,扩增带多为显性表现。（6） AFLP标记；基于PCR扩增。原理是选择性扩增园艺植物基因组DNA的双酶切片段,检测的多态性是酶切位点的变化或酶切片段间DNA序列的插入和缺失。AFLP标记是用DNA限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群体的DNA,然后对酶切产物进行选择性扩增,最后在形成的扩增产物中发现不同。这种不同就是与目的性状相连锁的AFLP标记。（7） SRAP和TRAP标记：基于PC

50、R扩增。SRAP标记原理是利用外显子G/C含量丰富而内含子A/T含量丰富的特点,分别是即正向引物和反向引物,对可读框的外显子和内含子、启动子进行PCR扩增,从而产生基于外显子和内含子的多态性。TRAP差别仅在于引物不同。（8） STS、SCAR、CAPS标记（9） SNP标记：基于Southern杂交和PCR扩增。园艺植物基因组由于单个核苷酸变异而引起DNA序列多态性,包括单碱基转换、颠换以及单碱基的插入或缺失。4.园艺植物分子标记数据收集过程中应注意哪些问题？答：多态性=总条带数-共有条带数/总条带数 相关系数,距离系数,联合系数。5.分子标记在园艺植物研究中的应用主要体现在哪些方面？答：1

51、分子遗传图谱构建和基因定位分子遗传图谱构建园艺植物分子遗传图谱的构建及基因定位 2分子标记辅助选择育种与目标基因连锁分子标记的获得 园艺植物分子标记辅助选择 3遗传多样性和亲缘关系分析 4核心种质构建 核心种质构建的原理 园艺植物核心种质的构建 5园艺植物品种鉴定与纯度分析6.构建园艺植物分子遗传图谱时常用的分离群体有哪些？各有何优缺点？方法优点缺点F2分离群体分离群体容易构建存在杂合基因；不能长久保存BC1分离群体直接放映F1配子分离比例不能长久保存F1分离群体DH分离群体稳定繁殖；直接放映F1配子分离比例花药培养破坏DH遗传结构,偏分离,影响作图RIL分离群体纯合永久分离群体构建周期长7.

52、利用BSA法获得与园艺植物目标性状紧密连锁分子标记的原理是什么？答：BSA法的原理是将分离群体中的个体依据研究的目标性状如抗病和染病分成两组,在每组群体中把各个个体的DNA等量混合,形成两个DNA混合池。因此又称为近等基因池法。它克服了许多植物不易获得近等基因系的缺点。8.构建园艺植物核心种质的基本步骤有哪些？1数据收集：收集所有种质资源的现有数据资料。2数据分组：把具有相似数据的种质资源分为一组。3样品选择：把所有种质资料科学地分组后,以合理的取样方法及取样比例选取核心种质。4核心种质管理：建立完善的核心种质繁殖、供种及管理体制,以保证核心种质的有效利用。第十三章1.生物信息学研究的任务及内

53、容： 任务：以计算机科学、工程和应用数学为基础,进行相关的生物信息的获取,加工、储藏、分配、分析和解释等,即依赖试验和衍生数据的大量存储,将各种各样的生物信息,如基因序列、染色体定位、基因产物的结构和功能及个生物中间的进化关系进行搜集、分类和分析,并实现全世界生命科学界的信息资源共享。 内容：1生物信息的收集储藏和管理。2基因序列信息的分析,开发信息检索工具及之后的信息自动化处理3基因功能分析,阐明基因功能 4生物大分子结构模拟预测5生物信息分析的技术与方法软件、数据库、数据库的分析工具、新方法、新技术2.常用的生物信息学数据库有哪些 基本数据库DNA序列,蛋白质序列和结构 二级数据库对基本数

54、据库的分析、提炼、加工 1DNA数据库：GenBank EMBL欧洲 DDBJ Biosino 2基因组数据库 人类基因组数据库、酵母基因组数据库、 拟南芥基因组数据库 3蛋白质序列数据库 SWISS-PROT：序列、结构域、功能、修饰、突变体 TrEMBL PIR数据库4部分：PIR1序列清楚；PIR2序列被检测分类,但冗 余；PIR3未被检测；PIR4未被验证 NRL-3D 蛋白质三维结构已知 OWL数据库 4蛋白质结构数据库：PBD数据库 SCOP数据库 CATH数据库 5蛋白质组数据库3.生物信息学在园艺植物上的应用1寻找园艺植物新基因：利用EST数据库发现新基因确定编码区序列同源搜索

55、2克隆新基因：3预测园艺植物基因区域4预测园艺植物基因功能5预测园艺植物蛋白质结构6分析园艺植物系统进化关系：核酸,蛋白质序列同源性1.特征数据：基因,个体,群体,物种的信息2.相似性数据4.生物技术发明专利申请需具备的条件1实质条件：新颖性,创造性,实用性2形势条件：专利申请书、说明书、说明书摘要、专利要求书3特殊条件：当申请涉及公众所不能获得的微生物时,需提交保存步骤5.基因专利有哪些特点自己总结的1基因功能确定2与已公开的基因序列和蛋白质编码的基因序列同源性不能太高,除非休市部分具有特殊效果3基因本身和它们编码的氨基酸受保护,未经许可不得制造,使用,销售,进出口基因专利的种类：基因方法专

56、利、基因产品专利、转基因动植物专利、基因产品用途专利、基因本身专利6.生物技术发明专利存在的问题1基因是否具有可专利性问题2基因专利是否符合单一性3基因专利的充分公开和权力要求范围4关于动植物品种是否站立保护专利问题5道德伦理问题还有一些知识点吧1.生物信息学检索系统：SRS信息学检索系统、Entrez信息学检索系统、DBGET/linkDB信息学检索系统2.核酸和蛋白质同源性比对检索分析系统：从核酸和氨基酸层面分析序列间的相似性、同源性,推测结构和功能上的进化关系3.申请专利的步骤：1确定具体发明点2是否具有一定新颖性3完成形式文件的准备4递交申请5缴费6初审7实审第十四章1.为什么要对转基

57、因技术进行安全性评价？部分人群对这一技术持怀疑态度,认为还不能对他的潜在威胁性做出安全新评价主要理由：1常规育种模拟自然,基因重组和交流范围有限,长期实践没有发生什么灾难性后果。2转基因把任何生物甚至人工合成基因导入植物,自然界不可能发生,对其后果无法预测。3通过安全性评价积累数据可判断基因植物的田间释放或大规模生产是否安全,并对其安全隐患加以限制,避免人类生存及生态环境收到破坏。2.转基因植物存在哪些潜在风险？一是转基因植物本身带来的潜在风险；而是基因漂流对其他植物带来的影响,从而个人神态带来威胁。1转基因植物成为杂草的可能性：在引入地持续存在入侵改变其他植物栖息地扩散至其他区域2转基因植物

58、通过基因漂流对近缘物种的潜在威胁转基因植物中的抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境等基因通过转入其他物种和近缘物种而是原先不是杂草的物种变成杂草。多样性消失转基因流入杂草,似的杂草难以控制3.杂草有那些特征？1环境适应能力强,可在多种不同环境下萌发生长2种子可长期保存3营养生长迅速,很快进入花期4只要条件适宜,植物可以持续产生种子5不是绝对的自花传粉6花粉可以通过媒介传播7恶劣环境也能产生种子8种子具有远近不同能力的传播途径9如是多年生,营养生长能力和再生能力强10能够丛生、攀援生长、产生有毒化合物抑制其他植物生长4.转基因食品对人类健康存在的可能影响1毒性2过敏3营养不均衡4对抗生素的抵抗作用：抗性

59、基因转到胃肠道微生物或上皮细胞中,成功表达,对抗生素产生抗性。5.什么是实质等同性？转基因食品与目前市场上销售的传统食品是否具有实质等同性。概念：如多某一新型食品或制品成分与目前市场上销售的食品或食品成分在实质上相同,那在安全性反面,前者与后者等同处理。6.我国生物安全管理实施原则有哪些1研究开发与安全防范并重2贯彻预防为主的原则3有关部门系统合作4公正且科学5公众参与6个案处理并逐步完善原则7.加强转基因植物生物安全对策有哪些？1加强生物安全立法2加强转基因植物及其产品的安全性评价3建立健全的生物安全监管机制4建立生物安全防治的相关制度5积极开展国际合作交流6重视信息情报工作自己认为重要的东西：1.生物安全定义：有人类不当活动干扰、侵害、损害、威胁生物种群的正常生存发展而引起的包括生物、生态系统、热体健康和公司财产到环境污染、破坏、损害。2.生物入侵方式：出于生态安全建设、生态保护等目的贸易、运输、旅游3.未来应用情况：2025前六：美、阿根廷、加、中、南非、澳大利亚4.外源基因对植物受体的影响：1标记基因影响：通过基因漂流产生超级杂草、对土壤微生物的影响2外源基因的影响：3插入对职植物响：导致部分基因失活,代谢紊乱.

)进行分析，以确保序列中不含有潜在的启动子元件。所有引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

PCR反应结束后，产物于1%琼脂糖凝胶中电泳后在紫外分析仪中切下目的片段，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后以回收的片段为混合模板，lacZ-F2、lacZ-F3和lacZ-R为扩增引物，进行第二轮PCR，再次进行电泳并切胶回收，用Bgl Ⅱ和XbaⅠ对回收目的片段进行双酶切，连入同样经Bgl

1.4 启动子报告载体的构建在质粒pFLX107-lacZ的基础上，通过多克隆位点置换和序列改造构建出一系列基于lacZ基因的启动子报告载体，用于后续筛选。首先，参照Fu等所述方法^[]将寡聚核苷酸片段MCS1-F/ MCS1-R和MCS2-F/MCS2-R溶于STE缓冲液中(10 Ⅱ和NdeⅠ间的酶切序列以变性退火的寡聚核苷酸片段MCS6-F/MCS6-R置换构建而成()。

1.5 大肠杆菌MC4100感受态细胞的制备大肠杆菌MC4100感受态细胞的制备参照Sambrook等所述方法进行适应性修改^[]，具体操作为：用接种环从冻存的大肠杆菌MC4100甘油保存液中沾取少量菌液划线于LB平板，置生化培养箱中37 ℃培养16–24 h，然后用无菌牙签挑取单个菌落，接种于装有5 mL LB液体培养基的试管中，于37 ℃恒温振荡器培养过夜。次日取100 μL细菌培养液于10 mL的LB液体培养基中振荡培养3–4 h，待OD₆₀₀值达到0.3–0.4时取出培养瓶，分装于1.5 mL离心管中，8 000 r/min离心30 s，弃去上清液，向沉淀中加入500 μL预冷的0.1 mol/L ℃冰箱保存备用。
1.6 启动子报告载体的背景活性测定将上述构建成功的系列启动子报告质粒pFGH01-pFGH06和参考质粒pRCL通过热激转化至大肠杆菌MC4100，再接种至100 mL含氯霉素(35 μg/mL)的LB液体培养基中，分别于28 ℃和37 ℃培养至对数生长期，参照Thongaram等所述方法并略有修改进行β-半乳糖苷酶活性测定^[]。具体为：取至少2 mL培养液，6 ℃孵育观察，待呈现足够黄色后，加入0.5 mL 1 mol/L Na₂CO₃溶液停止反应，再次准确记录加入时间。转移1 mL液体至EP离心管，以最大转速离心5 min以去除细菌残骸和氯仿，测定每管在420 nm和550 nm处的OD值。β-半乳糖苷酶活性以Miller Units (pFGH06)混合并作适当稀释后，分别涂布于仅含有X-gal的LB抗性平板和同时加有X-gal/阿拉伯糖的LB抗性平板，置于28 ℃培养。待长出菌落后，每组用无菌牙签随机挑取10个蓝色菌落，用引物DSeq-F/DSeq-R进行菌液PCR鉴定，并随机送3株阳性克隆至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.9 统计分析采用软件SPSS22.0对所得数据进行统计分析，数据差异采用t检验，P < 0.05和P < 0.01分别作为差异显著和极显著的判定标准。
bp的预期目的片段。然后以回收的片段为混合模板，lacZ-F2、lacZ-F3和lacZ-R为扩增引物，进行第二轮重叠PCR，成功获得3 119 bp含突变位点的lacZ基因及附加序列的全长片段()。最终的测序结果亦显示原lacZ基因中的ClaⅠ、SacⅠ、NdeⅠ酶切位点被成功消除，并且突变序列符合预期。

2.2 启动子报告载体的构建对构建而成的系列启动子报告质粒pFGH01-pFGH06，以DSeq-F和DSeq-R引物进行PCR鉴定，可分别扩增出大小约为328 bp、309 bp、416 bp、397 bp、401 bp和399 bp的预期目的片段，而作为参照的pRCL质粒则未能扩增出片段()。

为消除质粒超螺旋结构对其电泳体积大小的判断，用限制性内切酶Bgl Ⅱ对质粒pFGH01-pFGH06进行单酶切，同时用PstⅠ对质粒pRCL进行单酶切，然后进行电泳，结果显示经Bgl Ⅱ单酶切的线性质粒pFGH01-pFGH06均位于5 000 bp附近，与预期大小(分别为4 878 bp、4 859 bp、4 966 bp、4 947 bp、4 951 bp和4 949 bp，见)相符()。最终所构建质粒的测序结果也均与设计序列一致。

DSeq-R对随机挑取培养的目的克隆进行菌液PCR鉴定，所有克隆均可扩增出预期目的条带，大小分别约为498 bp和1 571 bp ()，随机送样测序结果也均符合预期。

讨论β-半乳糖苷酶广泛存在于多种生物中，能水解乳糖为半乳糖和葡萄糖，也具有转移半乳糖苷的作用，可将乳糖转变为异乳糖，而后者是乳糖操纵子的诱导物，在细菌的代谢过程中有着非常重要的作用^[]。此外，β-半乳糖苷酶性质稳定，能使多种底物显色，具有多样化的读出过程，且在厌氧环境下仍能发挥功能，这些优点使得其编码基因lacZ自20世纪60年代末被分离以来就成为基因工程实验中的一个常用报告基因^{[-, ]}，其中用于启动子的筛选、验证或效能测定等便是其众多应用中非常重要的一个方面。
在实际应用中，为了降低潜在的背景活性干扰，基于lacZ基因的原核启动子报告系统多以低拷贝质粒为骨架构建而成，但由于体积较大，会导致实验操作成本增加并降低对弱启动子的检测灵敏度。为解决上述问题，本研究将pUC型质粒复制子引入到启动子报告系统之中。作为质粒pBR322的衍生体，pUC型质粒的复制子缺乏控制拷贝数的rop基因，同时在复制引物RNAⅡ区域存在点突变，这使得其在大肠杆菌内的拷贝数数倍于亲本质粒，不过降低培养温度可抑制这一表型效应^[]，这一结论也在本次研究中再次得到证实，以高拷贝质粒pFLX107 (pUC型质粒)为基础构建而成的系列质粒pFGH01-pFGH06在28 ℃培养条件下的背景活性均极显著低于其在37 ℃培养条件下的背景活性。而基于p15A复制子的参考质粒pRCL在这两种温度下的活性大小相近，没有显著差异。值得注意的是，在两种温度下，质粒pFGH01和pFGH02的背景活性均显著高于其衍生质粒pFGH03和pFGH04。鉴于两者在结构上仅相差一个终止子t0，因此对这一现象的可能解释便是，t0的加入有效阻止了多克隆位点前序列中潜在的启动子泄露。
在所构建的pFGH系列质粒中，pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒，在28 ℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性。进一步的评估测试显示，质粒pFGH06可用于诱导型启动子和组成型启动子的克隆及活性测定，而且在模拟应用于启动子筛选时，仅通过蓝白斑筛选即可实现对于目标启动子的完全识别。这一切也表明，只要进行合理的序列结构设计，同时改进和完善相关实验方法，pUC型高拷贝质粒亦可用作启动子报告系统。
与已报道的研究相比，本研究中所构建的原核启动子报告系统pFGH06具有以下优点：①pUC型质粒为高拷贝质粒，但由于pUC型质粒复制子的温度相关性，使得其在具体应用时具有一定的灵活性，可根据实验目的进行相应培养温度的调整，从而调节其背景活性；②更小的体积(仅4 949 bp)，有利于提高质粒的稳定性和转化效率；③在紧邻报告基因前无启动子区域具有更多的克隆位点，便于序列中含有酶切位点启动子的克隆或筛选；④对原核启动子具有高效的识别效率。这些特点使得其在用于原核启动子的筛选和鉴定时具有更大的适应性，预期具有广泛的应用前景。