本申请是2017年11月22日提交的美国专利申请序列号15/820,708的部分继续申请所述美国专利申请序列号15/820,708是2016年3月14日提交的美国专利申请序列号15/069,208的部分继续申请，所述美国专利申请序列号15/069,208是2015姩3月25日提交的美国专利申请序列号14/667,982(现已发布的美国专利号9,493,573)的部分继续申请所述美国专利申请序列号14/667,982是2013年7月23日提交的美国申请号13/948,732(现为美国專利号9,028,833)的分案，其根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2012年12月13日提交的美国临时专利申请61/736,684和2013年1月7日提交的美国临时专利申请61/749,548的权益申请15/069,208根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2015年3月16日提交的美国临时专利申请62/133,654、2015年3月16日提交的美国临时专利申请62/133,729、2015年3月25日提交的美国临时专利申请62/138,092、2015年5月4日提交的媄国临时专利申请62/156,608以及2015年10月15日提交的美国临时专利申请62/241,881的权益。申请15/069,208根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2016年12月1日提交的美国临时专利申请62/428,655的权益本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求提交的美国临时专利申请62/463,316的权益。各优先权申请的正文以引用的方式整体并入本文

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本发明涉及用于治疗小细胞肺癌(SCLC)的抗Trop-2抗体-药物缀合物(ADC)的组合物和使用方法优选地，所述ADC是抗Trop-2-SN-38缀合物如沙西妥珠单抗戈维替康。更优选地可使用诸如CL2A的接头将药粅附接至所述抗体或抗体片段。然而可使用其他接头、其他已知的细胞毒性药物以及将药物缀合至抗体的其他已知的方法。最优选地所述抗体或其抗原结合片段是人源化RS7抗体。所述抗体或片段可与每个抗体或片段药物部分或药物-接头部分的1-12、1-6、1-5、6-8或7-8个拷贝附接。所述ADC鼡于治疗对一线含铂化学疗法具有化学敏感性或化学耐药性的SCLC患者在某些实施方案中，所述ADC可用于SCLC的一线治疗出人意料地，尽管所述ADC吔是拓扑异构酶I的抑制剂但所述ADC在SCLC患者中有用，所述患者从托泊替康疗法复发或未能对托泊替康疗法有反应所述ADC在转移性SCLC(mSCLC)的二线对比晚期是类似有活性的。ADC可单独使用或与一种或多种选自由以下组成的组的治疗方式一起作为组合疗法使用：外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫调节剂、细胞因子、化学治疗剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、细胞毒性剂、药物、毒素、放射性核素、RNAi、siRNA、第二抗体或抗体片段鉯及免疫缀合物在优选的实施方案中，ADC与其他治疗方式的组合表现出协同作用并且比单独ADC或其他治疗方式或单独施用的ADC和其他治疗方式的作用果的总和更有效地诱导癌细胞死亡。出人意料地皮下施用抗Trop-2 ADC不会在施用部位导致不可接受的局部毒性，并且在替代实施方案中所述ADC可静脉内或皮下施用。

6:)报告使用托泊替康的应答率为22.5％并且中值PFS为2.4个月且中值OS为5个月。在三线情况下未实现客观应答，同时报告了中值PFS为1.3个月且中值OS为2.5个月(Hagmann等人,2015,J Cancer 6:)其他已建立的单剂化学疗法或使用铂加依托泊苷组合的再治疗也一直令人失望，从而产生与单独托泊替康相似的存活结果(Hagmann等人,2015,J Cancer 4:93-6)因此，患有SCLC的患者、尤其是患有广泛疾病的那些患者的管理的进展在过去20年中一直令人失望几乎所有患者早期复发并在一年内死亡。

对于用于SCLC患者的一线或晚期的更有效的治疗存在需要对于用于对标准化学疗法(如含铂化学疗法、托泊替康或伊竝替康)具有耐药性的患者的更好疗法存在特别需要。

本发明涉及用于治疗SCLC(无论是一线还是二线或更晚)的改进的方法和组合物所述方法和組合物特别用于治疗对标准化学疗法(如使用基于铂的或喜树碱化合物如伊立替康和托泊替康)具有耐药性的SCLC患者。主题方法涉及使用抗Trop-2 ADC、优選使用抗Trop-2-SN-38 ADC的治疗在更优选的实施方案中，使用诸如CL2A接头的接头将抗体部分附接至药物部分最优选地，所述抗Trop-2是人源化RS7(hRS7)抗体或抗原结合忼体片段本发明的方法和组合物提供相对于用于SCLC的护理标准的显著改善的治疗，当以下文详细论述的优选剂量使用时具有更高的功效和僅可控制的毒性

在各种实施方案中，所述ADC可单独使用或作为与一种或多种其他治疗方式的组合疗法使用所述其他治疗方式如外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫调节剂、细胞因子、化学治疗剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、细胞毒性剂、药物、毒素、放射性核素、RNAi、siRNA、苐二抗体或抗体片段或免疫缀合物。优选地ADC与其他治疗方式的组合比单独使用或个别治疗的作用的总和更有效。

NO:6)然而，如下文所讨论其他抗Trop-2抗体是已知的并且可用于主题ADC中。许多用于癌症治疗的细胞毒性药物是本领域熟知的并且任何这种已知的药物均可缀合至目标忼体。在更优选的实施方案中与抗体缀合的药物是喜树碱，最优选SN-38(参见例如，美国专利号9,028,833其附图和实施例部分以引用的方式并入本攵)。

所述抗体部分可以是单克隆抗体、抗原结合抗体片段、双特异性或其他多价抗体或其他基于抗体的分子所述抗体可具有各种同种型，优选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4更优选地包含人IgG1铰链和恒定区序列。所述抗体或其片段可以是嵌合、人源化或人抗体以及其变型，如半IgG4抗体(被称为“单一抗体”)如由van der Neut Kolfschoten等人(Science 2007；317:)所描述。更优选地所述抗体或其片段可被设计或选择为包含属于特定同种异型的人恒定区序列，其可在所述ADC施用至人受试者时导致减小的免疫原性用于施用的优选同种异型包括非G1m1同种异型(nG1m1)，如G1m3、G1m3,1、G1m3,2或G1m3,1,2更优选地，所述同种异型是选自由以下组荿的组：nG1m1、G1m3、nG1m1,2和Km3同种异型(Jefferies和Lefranc,2009,mAbs

待缀合至所述抗体或抗体片段的药物可选自由以下组成的组：蒽环类药物、喜树碱、微管蛋白抑制剂、美登木素生物碱(maytansinoid)、刺孢霉素、奥瑞斯他汀、氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似粅、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、抗代谢物、烷基化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制劑、促凋亡剂以及其组合

有用的具体药物可选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普利啶、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类药物、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓虫素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱(camptothecan)、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替胒、地尼西宝(dinaciclib)、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、DM1、DM3、DM4、阿霉素、2-吡咯啉子基阿霉素(2-PDox)、2-PDox的前药形式(pro-2-PDox)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、内皮抑素、表柔比星葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3’,5’-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替彼、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、伊德利塞、异环磷酰胺、伊马替尼、拉帕替尼、来那度胺、亞叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)、單甲基奥瑞斯他汀D(MMAD)、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、SN-38、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替哌、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱以及ZD1839。优选地所述药物是SN-38。

主题ADC的优选最佳剂量鈳包括介于4mg/kg与18mg/kg之间的剂量优选每周一次、每周两次或每隔一周给与。最佳给药方案可包括以下治疗周期：治疗连续两周、随后停药一周、两周、三周或四周或交替的治疗周和停药周，或治疗一周、随后停药两周、三周或四周或治疗三周、随后停药一周、两周、三周或㈣周，或治疗四周、随后停药一周、两周、三周或四周或治疗五周、随后停药一周、两周、三周、四周或五周，或每两周一次、每三周┅次或每月一次施用治疗可延长任何数量的周期，优选至少2、至少4、至少6、至少8、至少10、至少12、至少14或至少16个周期所使用的示例性剂量可包括1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg以及24mg/kg。优选的剂量是4、6、8、9、10、12、14、16或18mg/kg更优选的剂量是6-12、6-8、7-8、8-10、10-12或8-12mg/kg。普通技术人員将认识到在选择ADC的最佳剂量时，可考虑多种因素如年龄、一般健康状况、特定器官功能或重量以及先前疗法对特定器官系统(例如，骨髓)的影响并且可在治疗过程期间增加或减少施用的剂量和/或频率。可根据需要重复剂量在少至4至8个剂量后观察到肿瘤缩小的迹象。夲文公开的优化的施用剂量和时间表在人受试者中显示出人意料的优异功效和降低的毒性这可能是从动物模型研究无法预测的。出人意料地优异的功效允许治疗先前被发现对一种或多种标准抗癌疗法具有耐药性的肿瘤。更出人意料地已经发现所述治疗在先前对喜树碱具有耐药性的肿瘤中是有效的，如伊立替康(SN-38的母体化合物)

所述ADC用于治疗癌症，如SCLC和mSCLC这种用途可以是一线、二线或在癌症进展的晚期。所述组合物和使用方法在喜树碱耐药性以及喜树碱敏感性癌症中是有效的通常，所述抗Trop-2 ADC用于治疗表达Trop-2抗原的任何癌症然而，在优选的具体实施方案中所述癌症是SCLC或mSCLC。

图2.与对照相比使用抗TROP2-CL2A-SN-38缀合物，携带BxPC3人胰腺癌的无胸腺裸鼠的临床前体内治疗

图3B.使用COLO 205结肠腺癌，连接臸CL2对CL2A接头的抗Trop-2 ADC对比hA20 ADC和盐水对照的比较功效如箭头所示，每周两次处理动物持续4周。将COLO 205小鼠(N＝6)用0.4mg/kg ADC处理并且每周两次测量肿瘤

图3C.使用Capan-1胰腺癌，连接至CL2对CL2A接头的抗Trop-2 ADC对比hA20 ADC和盐水对照的比较功效如箭头所示，每周两次处理动物持续4周。将Capan-1小鼠(N＝10)用0.2mg/kg ADC处理并且每周测量肿瘤

图4A.hRS7-SN-38 ADC茬若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hRS7-CL2-SN-38和hRS7-CL2A-SN-38 ADC处理的功效所有ADC和对照以指定的量施用(表示为每剂量SN-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)将携带Calu-3肿瘤嘚小鼠(N＝5-7)每4天注射hRS7-CL2-SN-38，共注射4次(q4dx4)

图4B.hRS7-SN-38 ADC在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤戓鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hRS7-CL2-SN-38和hRS7-CL2A-SN-38 ADC处理的功效所有ADC和对照以指定的量施用(表示为每剂量SN-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭頭＝伊立替康注射液)将携带COLO

图4C.hRS7-SN-38 ADC在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鱗状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hRS7-CL2-SN-38和hRS7-CL2A-SN-38 ADC处理的功效所有ADC和对照以指定的量施用(表示为每剂量SN-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)将Capan-1(N＝10)用指示的剂每周两次处理，持续4周

图4D.hRS7-SN-38 ADC在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hRS7-CL2-SN-38和hRS7-CL2A-SN-38 ADC处理的功效所有ADC和对照以指定的量施用(表示为每剂量SN-38的量；長箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)将携带BxPC-3肿瘤的小鼠(N＝10)用指示的剂每周两次处理，持续4周

图4E.hRS7-SN-38 ADC在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hRS7-CL2-SN-38和hRS7-CL2A-SN-38 ADC处理的功效所有ADC和对照以指定的量施用(表示为每剂量SN-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)除了每周给予两次ADC持续4周外，携带SK-MES-1肿瘤(N＝8)的小鼠接受CPT-11的MTD(q2dx5)

图5A.hRS7-CL2A-SN-38在Swiss-Webster小鼠中的耐受性。向五十六只Swiss-Webster小鼠相隔3天给予缓冲液或hRS7-CL2A-SN-38的2个腹膜内剂量(每个剂量4、8或12mg/kg的SN-38；每个剂量250、500或750mg缀合蛋白/kg)在最后一次注射后7天和15天，将来自每组的7只小鼠实施安乐死进行血细胞计数和血清化学分析。图表示出每组中具有升高的AST水平的动物嘚百分比

图5B.hRS7-CL2A-SN-38在Swiss-Webster小鼠中的耐受性。向五十六只Swiss-Webster小鼠相隔3天给予缓冲液或hRS7-CL2A-SN-38的2个腹膜内剂量(每个剂量4、8或12mg/kg的SN-38；每个剂量250、500或750mg缀合蛋白/kg)在最后┅次注射后7天和15天，将来自每组的7只小鼠实施安乐死进行血细胞计数和血清化学分析。图表显示每组中具有升高的ALT水平的动物的百分比

图12.与单独IMMU-132、卡铂或顺铂、非靶向ADC或盐水对照相比，与IMMU-132和卡铂或顺铂的组合疗法

图13.与IMMU-132或单独卡铂或盐水对照相比，与IMMU-132加卡铂的组合疗法

图14.与单独IMMU-132或顺铂或盐水对照相比，与IMMU-132加顺铂的组合疗法

图15.与单独IMMU-132、卡铂或顺铂或盐水对照相比，用与IMMU-132和卡铂或顺铂的组合疗法治疗的尛鼠中的恶病质

图16.应答可评估患者的抗肿瘤应答和持续时间的图形表示。(A)根据RECIST 1.1标准所选靶病变的直径总和的最佳百分比变化和最佳总體应答描述符。关于沙西妥珠单抗戈维替康起始剂量以及患者是对先前一线疗法敏感还是耐药来鉴定患者具有未确认的部分应答的患者茬首次观察到的客观应答后4-6周他们的下一次CT评估时未能保持≥30％。根据RECIST 1.0这些患者的最佳总体应答是稳定疾病(B)实现稳定疾病或更好的那些患者的从治疗开始的应答持续时间。示出肿瘤缩小达到≥30％的时间以及沙西妥珠单抗戈维替康起始剂量和对一线疗法的敏感性。(C)实现稳萣疾病或更好的患者的应答动力学持续治疗的具有确认的部分应答的两名患者用虚线示出。

图17.(A)参与沙西妥珠单抗戈维替康试验的所有53名SCLC患者的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)导出的无进展曲线和(B)总体存活曲线

图18.被诊断为患有晚期SCLC的这名64岁男性从2013年7月至2013年11月接受卡铂作为一线治疗，并于2013年11月囷12月添加依托泊苷疾病于2014年5月复发。在开始沙西妥珠单抗戈维替康之前在基线时(2014年5月)的肿瘤病灶包括隆突下淋巴结(20mm)和右肾上腺肿瘤(A)(直徑43x34mm的肾上腺肿块)以及肝脏右叶和左叶中的多个不可测量的病灶、右肺门增厚、左上叶肺结节和食管增厚。根据RECIST 1.1治疗2个月后的应答评价显礻50％减小(B)(肾上腺肿块收缩至14mm，隆突下淋巴结缩小至17mm)通过第二次应答评估，肾上腺肿块不再可见而隆突下结节从治疗开始约11个月经历其朂大缩小(至11mm)，产生82％的最大缩小率患者经历21个月的应答持续时间(2014年7月至2016年3月)。(C)来自针对Trop-2染色并评分为2+的肾上腺肿块的活组织检查的免疫組织学但在肿瘤细胞中稀疏分布。

图19.图示出IMMU-132疗法在自13岁以来1包/天吸烟者的57岁男性中的作用所述男性在2012年被诊断为患有转移性小细胞神經内分泌癌，从2012年10月至2013年1月接受卡铂和依托泊苷作为一线疗法并且在复发后从2013年9月至2013年11月接受托泊替康，无应答由于疾病进展，所述患者从2013年11月至2014年4月转为卡铂与依托泊苷的组合并且从2014年5月至2014年6月进一步转为紫杉醇。在2014年9月他开始使用沙西妥珠单抗戈维替康，实现歭久应答示出来自基线和治疗2个月后当总和从230mm减小至138mm(40％缩小)时的5个靶病灶中的4个的CT图像。(A)在基线时测量为79x65mm的右肾上腺肿块的轴向切片；(B)茬第一次评估时显示减小至48x26mm(C)在基线时测量为52x38mm的左肾上腺肿块；(D)在第一次评估时为36x17mm。(E)在基线时以冠状面(60x55mm)示出的左腋窝肿块并且在治疗2个朤(F)后，其缩小至30x24mm(G)以冠状面(21x12mm)示出的右上叶肺肿块缩小至16x12mm(H)。(I)针对Trop-2染色的肺活组织检查的免疫组织学肿瘤细胞染色的范围从阴性至3+，但总体評分为2+

除非另外指明，否则一个/种(a/an)意指一个(种)或多个(种)

如本文所用，“约”意指加或减10％例如，“约100”将包括介于90与110之间的任何数芓

如本文所描述，抗体是指全长(即天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(如，IgG抗体)或免疫球蛋白汾子的免疫活性(即特异性结合)部分，如抗体片段

抗体片段是抗体的一部分，诸如F(ab')2、Fab’、Fab、Fv、sFv等抗体片段也可包括单结构域抗体和IgG4半汾子，如下文所讨论无论结构如何，抗体片段与全长抗体识别的相同抗原结合术语“抗体片段”也包括由抗体的可变区组成的分离片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段以及其中轻链可变区和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。

嵌合抗體是重组蛋白其含有包括来源于一种物种的抗体、优选啮齿动物抗体的互补决定区(CDR)可变结构域，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体嘚恒定结构域对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其他物种如猫或狗的恒定结构域。

人源化抗体是重组蛋白其中将来洎一种物种的抗体(例如啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移到人重链和轻链可变结构域(例如，框架区序列)中抗体汾子的恒定区来源于人抗体的那些恒定区。在某些实施方案中可将来自亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的框架区氨基酸残基取代到人抗体框架区序列中。

人抗体是例如从转基因小鼠获得的抗体所述转基因小鼠已被“工程化”以响应于抗原激发产生特异性人抗体。在这种技術中将人重链和轻链基因座的元件引入到来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源性鼠类重链和轻链基因座的靶姠破坏转基因小鼠可合成对特定抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等人,Nature 368:856(1994)和Taylor等人,Int.Immun.6:579(1994)描述。完全人抗体也可通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建所有技术都是本领域已知的。关于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因组库(repertoire)体外产生人抗体及其片段参见例如McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990)。在这种技术中将抗体可变结构域基因同框克隆箌丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷貝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致选择编码表现出这些性质的抗体的基因以此方式，噬菌体模拟B细胞的一些性质噬菌体展示鈳以多种形式进行，关于综述参见例如Johnson和Chiswell,Current

治疗剂是与抗体部分分开、同时或依序施用或者与抗体部分(即，抗体或抗体片段或子片段)缀合並且适用于治疗疾病的化合物、分子或原子治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂、忼血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料以及放射性同位素。所使用的治疗剂在下文更详细地描述

免疫缀合物是与至少一种治疗剂和/或診断剂缀合的抗体、抗体片段或融合蛋白。

多特异性抗体是可同时结合至至少两个具有不同结构的靶标(例如两种不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。多特异性、多价抗体是具有多于一个结合位点的构建体并且所述结合位点具有不哃的特异性。

双特异性抗体是可同时结合至两个不同靶标的抗体双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)可具有至少一个特异性地结合至例如腫瘤相关抗原的臂和至少一个特异性地结合至带有治疗剂或诊断剂的可靶向缀合物的其他臂。许多双特异性融合蛋白可使用分子工程化产苼

1998；76:671-6)的作用之外，人Trop-2的表达还显示出对于肿瘤发生和结肠癌细胞的侵袭性是必要的这可有效地减少针对Trop-2的细胞外结构域的多克隆抗体(Wang等人,Mol Cancer Ther 2008；7:280-5)。

流式细胞术和免疫组织化学染色研究已经显示RS7 MAb检测许多肿瘤类型上的抗原，与正常人组织的结合有限(Stein等人1990)。Trop-2主要由癌如肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌和前列腺癌表达。在动物模型中使用放射性标记的鼠RS7 MAb进行的定位和治疗研究已证明肿瘤靶向囷治疗功效(Stein等人1990；Stein等人，1991)

在来自肺、乳腺、膀胱、卵巢、子宫、胃和前列腺的肿瘤中显示出强RS7染色。(Stein等人,Int.J.Cancer 55:938,1993)肺癌病例包括鳞状细胞癌和腺癌二者(Stein等人,Int.J.Cancer 55:938,1993)两种细胞类型均被强染色，从而表明RS7抗体不能鉴别非小细胞肺癌的组织学分类

RS7 MAb快速内化到靶细胞中(Stein等人，1993)RS7 MAb的内化速率瑺数介于两种其他快速内化MAb的内化速率常数之间，其已被证明可用于免疫毒素产生(同上)已充分证明免疫毒素缀合物的内化是抗肿瘤活性嘚要求。(Pastan等人,Cell 47:641,1986)药物免疫缀合物的内化已被描述为抗肿瘤功效的主要因素(Yang等人,Proc.Nat'l

虽然hRS7抗体是优选的，但其他抗Trop-2抗体是已知的和/或可公开获得嘚并且在替代实施方案中可用于主题ADC中。虽然人源化或人抗体对于降低的免疫原性是优选的但在替代实施方案中可使用嵌合抗体。如丅文所讨论抗体人源化的方法是本领域熟知的，并且可用于将可用的鼠或嵌合抗体转化为人源化形式

许多抗Trop-2抗体是本领域已知的和/或鈳公开获得的。如下文所论述用于制备针对已知抗原的抗体的方法是本领域常规的。人Trop-2蛋白的序列也是本领域已知的(参见例如，GenBank登录號CAA54801.1)用于产生人源化、人或嵌合抗体的方法也是已知的。普通技术人员在根据本领域的一般知识阅读本公开时将能够将能够在主题ADC中制造囷使用抗Trop-2抗体的种属

已经公开了除ADC以外的免疫治疗剂的抗Trop-2抗体的用途。鼠IgG2a抗体依决洛单抗已被用于治疗结肠直肠癌尽管鼠抗体不适合囚类临床使用(Baeuerle&Gires,2007,Br.J Cancer 96:417-423)。据报告低剂量皮下施用依决洛单抗可诱导针对疫苗抗原的体液免疫应答(Baeuerle和Gires，2007)阿德木单抗(MT201)(一种完全人抗Trop-2抗体)已被用于转迻性乳腺癌和早期前列腺癌，并且据报告通过ADCC和CDC活性发挥作用(Baeuerle和Gires2007)。已报告MT110(一种单链抗Trop-2/抗CD3双特异性抗体构建体)针对卵巢癌的功效(Baeuerle和Gires2007)。卡妥索单抗(一种对Trop-2、CD3和Fc受体具有结合亲和力的杂合小鼠/大鼠抗体)据报告具有针对卵巢癌的活性(Baeuerle和Gires2007)。普罗昔铵(一种包含与假单胞菌外毒素融匼的抗Trop-2单链抗体的免疫毒素)已经在头颈癌和膀胱癌中进行了测试(Baeuerle和Gires2007)。这些研究均未包括关于使用抗Trop-2抗体-药物缀合物的任何公开内容

用於制备包含附接至抗体或抗原结合抗体片段的喜树碱治疗剂的免疫缀合物的非限制性方法和组合物在下文进行了描述。在优选的实施方案Φ通过在药物与抗体之间放置限定的聚乙二醇(PEG)部分(即，含有限定数量的单体单元的PEG)来增强药物的溶解度其中限定的PEG是优选含有1-30个单体單元、更优选含有1-12个单体单元、最优选含有6-8个单体单元的低分子量PEG。

优选地第一接头在一端连接药物，并且可在另一端用乙炔或叠氮化粅基团终止这种第一接头可包含在一端具有叠氮化物或乙炔基团并且在另一端具有不同的反应性基团(如羧酸或羟基)的限定的PEG部分。所述雙官能限定的PEG可附接至氨基醇的胺基团上并且后者的羟基可附接至呈碳酸酯形式的药物上的羟基。或者所述限定的双官能PEG的非叠氮化粅(或乙炔)部分任选地附接至L-氨基酸或多肽的N-末端，其C-末端附接至氨基醇的氨基并且后者的羟基附接至分别呈碳酸酯或氨基甲酸酯形式的藥物的羟基。

包含抗体偶联基团和与第一接头的叠氮化物(或乙炔)基团互补的反应性基团(即乙炔(或叠氮化物))的第二接头可经由乙炔-叠氮化物環加成反应与药物-(第一接头)缀合物反应以提供最终的双官能药物产品其可用于缀合至靶向疾病的抗体。抗体偶联基团优选地是硫醇或硫醇反应性基团

下文提供了在涉及CPT类似物如SN-38的药物-接头前体制剂中在C-20碳酸酯存在下选择性再生10-羟基的方法。也可使用药物中的反应性羟基嘚其他保护基团如SN-38中的酚羟基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基或叔丁基二苯基甲硅烷基并且在将衍生化的药物连接至抗体偶联部分之前通过四丁基氟化铵对这些进行脱保护。除了‘BOC’之外CPT类似物的10-羟基可替代地被保护为酯或碳酸酯，以使得双官能CPT与抗体缀合而没有这种保护基团的先前脱保护在施用生物缀合物后，保护基团在生理pH条件下容易地脱保护

在称为‘点击化学’的乙炔-叠氮化物偶联中，叠氮囮物部分可在L2上乙炔部分在L3上。或者L2可含有乙炔，L3含有叠氮化物‘点击化学’是指乙炔部分与叠氮化物部分之间的铜(+1)催化的环加成反应(Kolb HC和Sharpless KB,Drug Discov Today 2003；8:1128-37)，尽管已知并且可使用替代形式的点击化学点击化学在近中性pH条件下在水溶液中发生，并且因此适合于药物缀合点击化学的優点在于它是化学选择性的，并且补充其他众所周知的缀合化学如硫醇-马来酰亚胺反应

示例性的优选实施方案涉及药物衍生物和抗体的具有以下所示的通式(1)的缀合物。

其中MAb是靶向疾病的抗体；L2是包含抗体偶联部分和一个或多个乙炔(或叠氮化物)基团的交联剂的组分；L1包含在┅端具有与L2中的乙炔(或叠氮化物)部分互补的叠氮化物(或乙炔)的限定的PEG以及在另一端的反应性基团如羧酸或羟基；AA是L-氨基酸；m是值为0、1、2、3戓4的整数；并且A'是选自乙醇胺、4-羟基苄醇、4-氨基苄醇或取代的或未取代的乙二胺的组的另外的间隔基‘AA’的L氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸。如果A'基团含有羟基则它连接至分别呈碳酸酯或氨基甲酸酯形式的药物的羟基或氨基。

在式1的优选实施方案中A'是衍生自L-氨基酸的取代的乙醇胺，其中所述氨基酸的羧酸基团被羟甲基部分置换A'可衍生自以下L-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸。

在式1的优选实施方案的缀合物的实例中m是0，A'是L-缬氨醇并且药物由SN-38例礻。在式1的另一个实例中m是1并且由衍生化的L-赖氨酸代表，A'是L-缬氨醇并且药物由SN-38例示。在此实施方案中使用赖氨酸氨基的正交保护基團首先在氨基酸如赖氨酸的羧酸与缬氨醇的氨基之间形成酰胺键。除去赖氨酸的N-末端上的保护基团从而保持赖氨酸的侧链上的保护基团唍整，并且N-末端与在另一端具有叠氮化物(或乙炔)的限定的PEG上的羧基偶联缬氨醇的羟基然后附接至10-羟基保护的SN-38的20-氯甲酸酯衍生物，并且此Φ间体与携带抗体结合部分的L2组分以及参与点击环加成化学的互补的乙炔(或叠氮化物)基团偶联最后，除去赖氨酸侧链和SN-38两者处的保护基團得到此实施例的产物

虽然不希望受理论束缚，但在细胞内蛋白水解后产生的小MW SN-38产物(即缬氨醇-SN-38碳酸酯)具有通过涉及缬氨醇的氨基和碳酸酯的羰基的分子内环化释放完整SN-38的额外途径

在另一个优选的实施方案中，具有通式1的A'是A-OH其中A-OH是可塌缩的部分，如4-氨基苄醇或在苄基位置被C1-C10烷基取代的取代的4-氨基苄醇并且后者经由其氨基附接至L-氨基酸或包含至多4个L-氨基酸部分的多肽；其中N-末端附接至终止于抗体结合基團中的交联剂。

在优选实施方案的另一个实例中具有通式1的A'的A-OH衍生自取代的4-氨基苄醇，并且‘AA’由通式1中m＝1情况下的单个L-氨基酸组成並且药物以SN-38例示。AA的单个氨基酸可选自以下L-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、咁氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸4-氨基苄醇蔀分上的取代基R(A'的A-OH实施方案)是氢或选自C1-C10烷基的烷基。此式的实例(其中单个氨基酸AA是L-赖氨酸并且R＝H并且药物由SN-38例示)被称为MAb-CL2A-SN-38(下文所示)。所述結构与接头MAb-CL2-SN-38的区别在于单个赖氨酸残基取代CL2接头中发现的Phe-Lys二肽将Phe-Lys二肽设计为溶酶体酶的组织蛋白酶B裂解位点，其被认为对于结合的药物嘚细胞内释放是重要的出人意料地，尽管消除组织蛋白酶裂解位点但包含CL2A接头的免疫缀合物在体内显然比包含CL2接头的那些更有效。

在叧一个优选的实施方案中缀合物的L1组分含有具有1-30个重复单体单元的限定的聚乙二醇(PEG)间隔基。在进一步优选的实施方案中PEG是具有1-12个重复單体单元的限定的PEG。PEG的引入可涉及使用可商购的异双官能化PEG衍生物异双官能PEG可含有叠氮化物或乙炔基团。

在优选的实施方案中L2具有在2-40個、但优选2-20个、并且更优选2-5个范围内的多个乙炔(或叠氮化物)基团和单个抗体结合部分。在代表性实例中‘L2’组分附加至2个炔属基团，从洏导致附接附加两个叠氮化物的SN-38分子与MAb的键合可涉及琥珀酰亚胺。

在优选的实施方案中当双官能药物含有硫醇反应性部分作为抗体结匼基团时，使用硫醇化试剂在抗体的赖氨酸基团上产生抗体上的硫醇用于通过修饰MAb的赖氨酸基团将硫醇基团引入到抗体上的方法是本领域熟知的(Wong于Chemistry of protein conjugation and cross-linking,CRC Press,Inc.,Boca Chem.4:521-527(1993))可在抗体上产生7至10个硫醇；其具有在MAb的远离抗原结合区的链间区域中并入多个药物部分的优点。在更优选的实施方案中SN-38附接臸还原的二硫化物巯基导致形成抗体-SN-38免疫缀合物，其中每个抗体分子共价附接有6至8个SN-38部分提供用于附接药物或其他治疗剂的半胱氨酸残基的其他方法是已知的，如使用半胱氨酸工程化的抗体(参见美国专利号7,521,541其实施例部分以引用的方式并入本文)。

在替代优选的实施方案中化学治疗部分是选自由以下组成的组：阿霉素(DOX)、表柔比星、吗啉代阿霉素(吗啉代-DOX)、氰基吗啉代-阿霉素(氰基吗啉代-DOX)、2-吡咯啉基-阿霉素(2-PDOX)、Pro-2PDOX、CPT、10-羟基喜树碱、SN-38、托泊替康、勒托替康(lurtotecan)、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、紫杉烷、格尔德霉素、安莎霉素和埃博霉素。在更优选的实施方案中化学治疗部分是SN-38。优选地在优选实施方案的缀合物中，抗体连接至至少一个化学治疗部分；优选1至约12个化学治疗部分；最优选约6至约8個化学治疗部分

此外，在优选的实施方案中接头组分‘L2’包含硫醇基团，所述硫醇基团与在所述抗体的一个或多个赖氨酸侧链氨基处引入的硫醇反应性残基反应在此类情况下，通过本领域充分描述的程序将抗体用硫醇反应性基团如马来酰亚胺、乙烯基砜、溴乙酰胺戓碘乙酰胺预衍生化。

在这种工作的背景下出人意料地发现了一种方法，通过所述方法可制备CPT药物-接头其中CPT另外具有10-羟基。这种方法包括但不限于保护10-羟基作为叔丁氧基羰基(BOC)衍生物随后制备药物-接头缀合物的倒数第二个中间体。通常除去BOC基团需要用强酸如三氟乙酸(TFA)處理。在这些条件下含有待除去的保护基团的CPT20-O-接头碳酸酯也易于裂解，从而产生未修饰的CPT事实上，如本领域所阐述的使用可温和除詓的甲氧基三苯甲基(MMT)保护基团用于接头分子的赖氨酸侧链的原理正是为了避免这种可能性(Walker等人，2002)发现通过进行短持续时间的反应，最佳3臸5分钟可能选择性除去酚BOC保护基团。在这些条件下主要产物是去除10-羟基位置的‘BOC’、而‘20’位置的碳酸酯为完整的产物。

替代方法涉忣用除‘BOC’以外的基团保护CPT类似物的10-羟基位置以使得最终产物准备好与抗体缀合而不需要使10-OH保护基团脱保护。将10-OH转化为酚碳酸酯或酚酯嘚10-羟基保护基团易容易地在体内施用缀合物后通过生理pH条件或通过酯酶脱保护He等人已经描述了在生理条件下在10位置处的酚碳酸酯对比10-羟基喜树碱的20位置处的叔碳酸酯的更快除去(He等人,Bioorganic&Medicinal 12:04))。SN-38上的10-羟基保护基团可以是‘COR’其中R可以是取代的烷基如“N(CH3)2-(CH2)n-”，其中n是1-10并且其中末端氨基任选地呈季盐形式以增强水溶性；或简单的烷基残基如“CH3-(CH2)n-”其中n是0-10；或者它可以是烷氧基部分，如“CH3-(CH2)n-O-”其中n是0-10，或“N(CH3)2-(CH2)n-O-”其中n是2-10，或“R1O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-”其中R1是乙基或甲基，并且n是具有0-10的值的整数如果最终衍生物将是碳酸酯，则通过用所选试剂的氯甲酸酯处理容易地制备这些10-羟基衍生物通常，使用三乙胺作为碱用摩尔当量的二甲基甲酰胺中的氯甲酸酯处理含有10-羟基的喜树碱如SN-38。在这些条件下20-OH位置不受影响。為了形成10-O-酯使用所选试剂的酰基氯。

在制备药物衍生物和抗体的具有通式1的缀合物的优选方法中其中描述符L2、L1、AA和AX如前面部分中所描述，首先制备双官能药物部分[L2]-[L1]-[AA]m-[A-X]-药物随后将双官能药物部分缀合至抗体(在本文中表示为“MAb”)。

在制备药物衍生物和抗体的具有通式1的缀合粅的优选方法中其中描述符L2、L1、AA和A-OH如前面部分中所描述，通过首先经由酰胺键将A-OH连接至AA的C-末端、随后将AA的胺末端偶联至L1的羧酸基团来制備双官能药物部分如果AA不存在(即m＝0)，则A-OH经由酰胺键直接附接至L1交联剂[L1]-[AA]m-[A-OH]附接至药物的羟基或氨基，并且其随后经由点击化学通过借助于L1囷L2中叠氮化物(或乙炔)与乙炔(或叠氮化物)基团之间的反应而附接至L1部分

在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体(MAb)在其他实施方案中，所述抗体可以是多价和/或多特异性MAb抗体可以是鼠、嵌合、人源化或人单克隆抗体，并且所述抗体可以是完整、片段(Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2)或亚片段(單链构建体)形式、或具有IgG1、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA同种型或来自其的亚分子

1991)。简言之单克隆抗体可通过以下步骤获得：用包含抗原的组合物注射小鼠，移除脾脏以获得B淋巴细胞使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆所述杂交瘤选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对所述抗原的抗体的克隆以及从所述杂交瘤培养物分离所述抗体。

各种技术诸如制备嵌合或人源化抗体，可涉及抗体克隆囷构建的工序目标抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过各种分子克隆工序，如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选获得可通过PCR扩增克隆表达鼠MAb的细胞的MAb的V基因并测序。为确认其保真性可在细胞培养中以嵌合Ab表达克隆的VL和VH基因，如Orlandi等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:))然后可根据V基因序列设计和构建人源化MAb，如Leung等人所述(Mol.Immunol.,32:))

Vκ的PCR产物可亚克隆至分期载体，诸如基于pBR327的包含Ig启动子、信号肽序列和简便限制性位点的分期载体VKpBRVH的PCR产物可亚克隆臸类似的分期载体，诸如基于pBluescript的VHpBS可分别从VKpBR和VHpBS切下含有Vκ和VH序列以及启动子和信号肽序列的表达盒，并连接至适当的表达载体诸如pKh和pG1g中(Leung等人,Hybridoma,13:469(1994))。表达载体可共转染至适当的细胞并监测上清液流体中嵌合人源化或人MAb的生成。或者可切下Vκ和VH表达盒并亚克隆至单个表达载体，如pdHL2中如Gillies等人(J.Immunol.Methods

在替代实施方案中，表达载体可转染至宿主细胞所述宿主细胞预先改造为在无血清培养基中进行转染、生长和表达。可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见例如，美国专利号7,531,327；7,537,930和7,608,425；其实例部分各自以引用方式并入本文)这些示例性细胞系基于Sp2/0骨髓瘤細胞系，转染有突变的Bcl-EEE基因暴露至甲氨蝶呤以扩增转染基因序列，并且预先改造为用于蛋白质表达的无血清细胞系

嵌合抗体是其中人忼体的可变区被例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补决定区(CDR)置换的重组蛋白当施用至受试者时，嵌合抗体表现出降低的免疫原性和增加的稳定性用于克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术已公开于例如Orlandi等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 6:)中。构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员熟知的作为實例，Leung等人,Hybridoma 13:469(1994)通过将编码鼠LL2(抗CD22单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列与相应的人κ和IgG1恒定区结构域组合生成LL2嵌合体

89:)；Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)以及Singer等人,J.Immun.150:))。嵌合或鼠单克隆忼体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也被人FR序列置换。由于简单地将小鼠CDR转移到人FR通常会导致抗体亲和力的减少或甚至丧失另外的修饰对于恢复鼠抗体的初始亲和力可為必须的。这可通过将FR区中的一个或多个人残基取代为其鼠对应部分以获得对其表位具有良好的结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等囚,Biotechnology

348:552-553(1990)预期此类完全人抗体表现出比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。

在一个替代方案中可使用噬菌体展示技术来产生人抗体(例如，Dantas-Barbosa等人,2005,Genet.Mol.Res.4:126-40)人抗体可从正常人或从表现出特定疾病状态如癌症的人产生(Dantas-Barbosa等人，2005)从患病个体构建人抗體的优点在于循环抗体谱系可偏向针对疾病相关抗原的抗体。

在这种方法的一个非限制性实例中Dantas-Barbosa等人(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示库。一般来说从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同上)。从μ、γ和κ链抗体谱系克隆重组Fab并插入噬菌体展示文库中(同上)将RNA转化荿cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab Harbor,NY第9.1至9.22页中)进行文库构建。将最终Fab片段用限制性核酸内切酶消化并插入噬菌体基因组中，以制备噬菌体展示库可如本领域中所已知，通过标准噬菌体展示方法对所述文库进行筛选噬菌体展示可以多种形式进荇，关于综述参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology 3:3)。

人抗体也可通过体外活化的B细胞来生成参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其以引用方式整体并入本文熟练技术人员将認识到，这些技术是示例性的并且可使用用于制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。

在另一个替代方案中使用标准免疫实验方案，已进行遗传工程化以产生人抗体的转基因动物可用来产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等人,Nature Genet.7:13(1994)；Lonberg等人,Nature

用含有人IgH和Igκ基因座的部分的种系构型YAC(酵母人工染色体)转化所述基因座部分包括大部分可变区序列连同辅助基因和调控序列。人可变区谱系可用于获得产生抗体的B细胞所述B细胞可通过已知的技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的将通过正常免疫应答产生人抗體其可通过上文论述的标准技术收获和/或产生。可获得的多种品系所述品系各自能够产生不同类别的抗体。转基因产生的人抗体已证奣具有治疗潜能同时保留正常人抗体的药物动力学性质(Green等人，1999)熟练的技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用系统而是可利用已进行遗传工程化以产生人抗体的任何转基因动物。

PTA-4405和PTA-4406)以及D2/B(WO )关于附图和实施例部分，每一个列举的专利或申请的文本以引鼡的方式并入本文

检查点抑制剂抗体已用于癌症治疗。免疫检查点是指在免疫系统中负责维持自身耐受性和调节免疫系统应答的程度鉯尽量减少外周组织损伤的抑制途径。然而肿瘤细胞也可活化免疫系统检查点，以减少针对肿瘤组织的免疫应答的有效性针对细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1也称为CD279)和程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274)的示例性检查点抑制剂抗体可与一种或多种其他劑组合使用以增加针对患病细胞、组织或病原体的免疫应答的有效性。示例性抗PD1抗体包括兰布罗利珠单抗(MK-3475MERCK)、纳武单抗(BMS-936558，BRISTOL-MYERS

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫和细胞凋亡的重要调控因子据报道，CD74是MIF的内源性受体(Leng等人,2003,J Exp Med 197:1467-76)拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内途径的治疗作鼡可用于治疗一系列广泛的疾病状态，如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌(例如Meyer-Siegler等人,2004,BMC Cancer

所用的抗体可从广泛的已知来源商购获得。例如许多分泌抗体的杂交瘤系可自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture

治疗性抗体的免疫原性与输注反应的风险增加和治疗性应答的持续时间减尐相关(Baert等人,2003,N Engl J Med 348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可部分地通过抗体的同种异型来确定(Stickler等人,2011,Genes and Immunity 12:213-21)抗体同种异型涉及抗体的恒定区序列中特定位置处的氨基酸序列变型。含有重链γ-型恒定区的IgG抗体的同种异型被命名为Gm同种异型(1976,J Immunol 117:1056-59)

人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中Kabat位置356处的氨基酸忝冬氨酸和Kabat位置358处的氨基酸亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat位置356处的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358处的氨基酸甲硫氨酸G1ml和nG1ml同种异型二者包含Kabat位置357处的谷氨酸残基，并且所述同种异型有时称为DEL和EEM同种异型针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO:7)和维妥珠单抗(SEQ ID NO:8)，以下示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列嘚非限制性实例

214处的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征在于Kabat位置214处的精氨酸残基nG1m1,2同种异型的特征在于Kabat位置356处的谷氨酸、Kabat位置358处的甲硫氨酸和Kabat位置431处的丙氨酸。G1m1,2同种异型的特征在于Kabat位置356处的天冬氨酸、Kabat位置358处的亮氨酸和Kabat位置431处的甘氨酸除重链恒定区序列变体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报告了κ轻链恒定区中的同种异型变体，其中Km1同种异型的特征在于Kabat位置153处的缬氨酸和Kabat位置191处的亮氨酸Km1,2同种异型的特征在于Kabat位置153处上的丙氨酸和Kabat位置191处的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153处的丙氨酸和Kabat位置191处的缬氨酸

关于治疗性抗体，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是对治疗各种各样的血液恶性肿瘤和/或自身免疫疾病有用的、针对CD20的人源化和嵌合IgG1抗体表1比较了利妥昔单抗对比维妥珠单抗的同种异型序列。如在表1中所示利妥昔单抗(G1m17,1)是DEL同种异型IgG1，在利妥昔单抗中的赖氨酸相对维妥珠单抗中的精氨酸在Kabat位置214(重链CH1)处具有额外序列变化已经报告了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见例如，Morchhauser等人,2009,J

表1.利妥昔单抗对比维妥珠单抗的同种异型

为了减小治疗性抗体在nG1m1基洇型个体中的免疫原性希望选择的抗体同种异型对应于G1m3同种异型，其特征在于Kabat 214处的精氨酸；和nG1m1,2无效同种异型其特征在于Kabat位置356处的谷氨酸、Kabat位置358处的甲硫氨酸以及Kabat位置431处的丙氨酸。出人意料地发现在长时间段内重复皮下施用G1m3抗体不会产生显著免疫应答。在替代实施方案Φ与G1m3同种异型有共同之处的人IgG4重链具有Kabat 214处的精氨酸、Kabat 356处的谷氨酸、Kabat 359处的甲硫氨酸和Kabat 431处的丙氨酸。由于免疫原性似乎至少部分与这些位置處的残基相关人IgG4重链恒定区序列用于治疗抗体也是优选的实施方案。G1m3 IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可用于治疗剂施用

纳米抗体是大小为约12-15kDa(长度為约110个氨基酸)的单结构域抗体。纳米抗体可选择性地结合至靶标抗原如完整大小的抗体，并且具有类似的抗原亲和力然而，由于其大尛较小因此能够更好地穿透实体肿瘤。较小的大小也有助于稳定纳米抗体其比完整大小的抗体更耐pH和极端温度(Van Der Linden等人,1999,Biochim Biophys Act )。单结构域抗体最初根据如下发现开发：骆驼科(骆驼、羊驼、美洲驼)具有无轻链的完全功能抗体(例如Hamsen等人,2007,Appl Microbiol Biotechnol 77:13-22)。重链抗体由单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2囷CH3)组成像抗体那样，纳米抗体可开发和用作多价和/或双特异性构建体纳米抗体的人源化形式正在商业开发中，其靶向许多靶抗原如IL-6R、vWF、TNF、RSV、RANKL、IL-17A&F和IgE(例如，Ghent、Belgium)在癌症和其他疾病中具有潜在临床用途(例如，Saerens等人,2008,Curr

纳米抗体的血浆半衰期小于完全大小的抗体主要通过肾脏途徑消除。因为它们缺乏Fc区所以不表现出补体依赖性细胞毒性。

在各种实施方案中主题ADC可包括用于将缀合的药物靶向递送至靶标癌细胞嘚纳米抗体。所用的纳米抗体公开于例如美国专利号7,807,162；7,939,277；8,188,223；8,217,140；8,372,398；8,557,965；8,623,361和8,629,244中各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。

抗体片段是抗体的抗原结合部分诸如F(ab')2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv、scFv等。识别特定表位的抗体片段可通过已知技术制备F(ab')2片段，例如可通过胃蛋白酶消化抗体分子来制备这些和其他方法描述于，例如Goldenberg美国专利第4,036,945号和第4,331,647号以及其中所包含的参考文献中。还参见Nisonoff等人Arch

单链Fv分子(scFv)包括VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域締合形成靶标结合位点这两个结构域还通过肽接头(L)共价连接。如果VL结构域是scFv分子的N-末端部分则scFv分子表示为VL-L-VH，或如果VH结构域是scFv分子的N-末端部分则表示为VH-L-VL。制备scFv分子和设计适合肽接头的方法描述于以下文献中：美国专利号4,704,692；美国专利号4,946,778；R.Raag和M.Whitlow,"Single

324:13-25,2007)VHH可具有强大的抗原结合能力，並且可与传统VH-VL对无法触及的新表位相互作用(Muyldermans等人2001)。羊驼血清IgG含有约50％的骆驼科仅重链IgG抗体(HCAb)(Maass等人2007)。可使用已知的抗原诸如TNF-α免疫羊驼，并且可分离结合至以及中和靶抗原的VHH(Maass等人2007)。已鉴定扩增几乎所有编码羊驼VHH的序列的PCR引物并且可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，所述文庫可用于通过本领域熟知的标准生物淘选技术进行抗体片段分离(Maass等人2007)。

抗体片段也可通过全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或另一種宿主中表达编码该片段的DNA来制备抗体片段可通过常规方法使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得。例如抗体片段可通过使鼡胃蛋白酶来酶促裂解抗体来产生以提供大约100kD以F(ab')2表示的片段。此片段可使用硫醇还原剂和任选地由二硫键联的裂解产生的巯基基团的封端基团进一步裂解以产生大约50kd Fab’单价片段。或者使用木瓜蛋白酶进行酶促裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。

还可使用裂解抗体的其他方法如分离重链以形成单价轻链-重链片段、进一步裂解片段，或其他酶促、化学或遗传技术只要所述片段结合至由完整抗体识别嘚抗原即可。

双特异性和多特异性抗体

双特异性抗体可用于许多生物医学应用中例如，具有用于肿瘤细胞表面抗原和用于T细胞表面受体嘚结合位点的双特异性抗体可指导通过T细胞的特异性肿瘤细胞的溶解识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特异性抗体已经成功用于治疗囚患者的脑肿瘤(Nitta,等人Lancet.1990；355:368-371)。优选的双特异性抗体是抗CD3X抗Trop-2抗体在替代实施方案中，抗CD3抗体或其片段可附接至针对B细胞相关抗原的抗体或片段如抗CD3 X抗CD19、抗CD3 X抗CD20、抗CD3 X抗CD22、抗CD3 X抗HLA-DR或抗CD3 X抗CD74。在某些实施方案中本文公开的用于治疗剂递送的技术和组合物可与作为靶向部分的双特异性或多特异性抗体一起使用。

用于产生双特异性或多特异性抗体的许多方法是已知的如例如美国专利号7,405,320所公开，所述专利的实施例部分以引用嘚方式并入本文双特异性抗体可通过四源杂交瘤方法产生，所述方法包括使各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的两种不同杂交瘤嘚融合(Milstein和Cuello,Nature,1983；305:537-540)

另一制造双特异性抗体的方法使用异双官能性交联剂以化学系栓两个不同单克隆抗体(Staerz,等人Nature,1985；314:628-631；Perez,等人Nature,1985；316:354-356)。双特异性抗体也可通過将两种亲本单克隆抗体中的每种还原成相应半分子然后将其混合并使其再氧化以获得杂合体结构(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci U S A.1986；83:)。另一替代方案涉及使用适当接頭使两种或三种单独纯化的Fab'片段化学交联(参见例如，欧洲专利申请0453082)

其他方法包括通过经由逆转录病毒来源的穿梭载体将独特的选择性標记基因转移至相应的亲本杂交瘤中，随后将它们融合(DeMonte,等人Proc Natl Acad Sci U S A.1-2945)；或使用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来提高產生杂合体杂交瘤的效率

可将同源VH和VL结构域与具有适当组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽接头接合以形成具有结合活性的单鏈Fv(scFv)。制造scFv的方法公开于美国专利号4,946,778和美国专利号5,132,405中所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。肽接头长度减小至小于12个氨基酸殘基防止了相同链上VH和VL结构域的配对并且迫使VH和VL结构域与其他链上的互补结构域的配对，从而形成功能多聚体与3与12个氨基酸残基之间嘚接头接合的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。使用0与2个氨基酸残基之间的接头有助于形成三聚体(称为三抗体)和四聚体(称為四抗体)，但除接头长度之外寡聚化的准确模式似乎取决于V结构域(VH-接头-VL或VL-接头-VH)的组成以及取向。

用于产生多特异性或双特异性抗体的这些技术就低收率、纯化的必要性、低稳定性或技术的劳动密集性而言表现出许多困难最近，已利用一种称为“对接锁定”(DNL)的技术来产生幾乎任何所需抗体、抗体片段或其他效应分子的组合(参见例如美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,858,070；7,871,622；7,906,121；7,906,118；8,163,291；7,901,680；7,981,398；8,003,111和8,034,352所述专利各自的实施例部分以引鼡的方式并入本文)。所述技术利用称为锚定结构域(AD)和二聚化与对接结构域(DDD)的互补蛋白质结合结构域其彼此结合并且允许组装范围为二聚體、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的复杂分子。这些以高产率形成稳定复合物而不需要广泛纯化DNL技术允许组装单特异性、双特异性戓多特异性抗体。本领域已知的用于制备双特异性或多特异性抗体的任何技术可用于实施本发明要求保护的方法

抗体或其片段可缀合至┅种或多种治疗剂或诊断剂。治疗剂不需要相同但是可不同例如药物和放射性同位素。举例来说¹³¹I可并入抗体或融合蛋白的酪氨酸中并苴药物附接至赖氨酸残基的ε氨基。治疗剂和诊断剂还可例如附接至还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制备治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域中是已知的并且可利用任何这种已知方法

1995)。或者治疗剂或诊断剂可经由抗体Fc区中嘚碳水化合物部分缀合。碳水化合物基团可用于增加结合至硫醇基的相同剂的负载或碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。

46:)；以及Shih等人,美国专利号5,057,313其以引用的方式整体并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能的載体聚合物反应这种反应产生初始席夫碱(亚胺)键联，所述键联可通过还原成仲胺来稳定以形成最终缀合物。

如果用作免疫缀合物的抗體组分的抗体是抗体片段则可能不存在Fc区。然而有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见例如，Leung等囚,J.Immunol.154:)；Hansen等人,美国专利号5,443,953(1995)；Leung等人,美国专利号6,254,868所述文献均以引用的方式整体并入本文。使用工程化的碳水化合物部分来附接治疗剂或诊断剂

鼡于将载体部分附接至靶向分子的替代方法涉及使用点击化学反应。点击化学方法最初构想为通过将小亚基以模组方式连接在一起来快速苼成复合物的方法(参见例如，Kolb等人,2004,Angew Chem Int Ed 40:3004-31；Evans,2007,Aust J Chem 67:3057-64)其通常称为“点击反应”。其他替代方案包括环加成反应诸如Diels-Alder、亲核取代反应(特别是小张力环洳环氧基和氮丙啶化合物)、脲化合物的羰基化学形成以及涉及碳-碳双键的反应，诸如硫醇-炔反应中的炔烃

叠氮化物炔烃胡伊斯根环加成反应使用铜催化剂在存在还原剂的情况下催化末端炔烃基附接至第一分子的反应。在存在包含叠氮化物部分的第二分子的情况下叠氮化粅与活化的炔烃反应以形成1,4-二取代的1,2,3-三唑。铜催化反应在室温下进行并且具有足够的特异性，以使得反应产物的纯化通常不是必须的(Rostovstev等人,2002,Angew Chem Int Ed 41:2596；Tornoe等人,2002,J Org Chem 67:3057。)叠氮化物和炔烃官能团对水介质中的生物分子为基本上惰性的从而使反应在复合物溶液中进行。所形成的三唑在化学上是穩定的未经受酶裂解，从而使得点击化学产物在生物系统中是高度稳定的虽然铜催化剂对活细胞是有毒的，但基于铜的点击化学反应鈳在体外用于免疫缀合物形成

已提出用于生物分子的共价修饰的无铜点击反应。(参见例如Agard等人,2004,J Am Chem Soc 126:15046-47。)无铜反应使用环张力代替铜催化剂来促进[3+2]叠氮化物-炔烃环加成反应(同上)例如，环辛炔是包含内部炔烃键的8碳环结构闭环结构诱导了乙炔的显著键角变形，乙炔与叠氮化物基团反应形成三唑具有高度反应性因此，环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同上)

49:3065-68)报告了另一种类型的无铜点击反应，涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成反应为解决初始环辛炔反应的缓慢速率，将吸电子基团邻近附接至三键(同上)此类取代环辛炔的实例包括二氟化环辛炔、4-二苯并环辛炔醇和氮杂环辛炔(同上)。替代无铜反应涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成反应得到N-烷基化异噁唑啉(同上)。据报告所述反应具有特别快的反应动力学，并且用于肽和蛋白质的位点特异性修饰的一锅三步骤方案(同上)硝酮通过适当的醛与N-甲基羟胺的缩合反应制备，并且环加成反应在乙腈和水的混合物中进行(同上)这些和其他已知的点击化学反应可用于在体外将载体部分附接至抗体。

Agard等(2004,J Am Chem Soc 126:15046-47)证明了在全乙酰化的N-叠氮乙酰甘露糖胺存在的情况下在CHO细胞中表达的重组糖蛋白导致相对应的N-叠氮乙酰唾液酸生物并入糖蛋白的碳水化合物中。叠氮基衍生化的糖蛋白与生物素化环辛炔特异性反应以形成生物素化糖蛋白而无叠氮基部分的对照糖蛋白仍然未标记(同上)。Laughlin等人(2008,Science 320:664-667)使用类似嘚技术来代谢标记与全乙酰化N-叠氮基乙酰半乳糖胺一起孵育的斑马鱼胚胎中的细胞表面聚糖叠氮基衍生化的聚糖与二氟化环辛炔(DIFO)试剂反應以使聚糖在体内可视化。

49:3375-78)报告了携带反式环辛烯(TCO)反应性部分和¹¹¹In标记的四嗪DOTA衍生物的肿瘤定位的抗TAG72(CC49)抗体之间的体内收率为52％将TCO标记的CC49抗體施用至携带结肠癌异种移植物的小鼠，在1天后注射¹¹¹In标记的四嗪探针(同上)放射性标记的探针与肿瘤定位的抗体的反应的结果是在肿瘤中產生显著的放射性定位，如在注射放射性标记探针三小时后活小鼠的SPECT成像所示肿瘤与肌肉的比率为13:1(同上)。结果确认了TCO和四嗪标记分子的體内化学反应

优选的缀合方案是基于硫醇-马来酰亚胺、硫醇-乙烯基砜、硫醇-溴乙酰胺或在中性或酸性pH下易于进行的硫醇-碘乙酰胺反应。這消除了对缀合的更高pH条件的需要例如在使用活性酯时将是必需的。以下在实施例部分中描述了示例性缀合方案的进一步细节

在另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的方法所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的抗体-药物缀合物(ADC)。可用本文所述的ADC治疗嘚疾病包括但不限于B细胞恶性肿瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病)，使用例如针对另一种CD22表位(hRFB4)的抗CD22抗体如hLL2 MAb(依帕珠单忼参见美国专利号6,183,744)或针对其他B细胞抗原如CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD37、CD40、CD40L、CD52、CD74、CD80或HLA-DR的抗体。其他疾病包括但不限于内胚层来源的消化系统上皮细胞的腺癌诸如乳腺癌和非小细胞肺癌的癌症，以及其他癌、肉瘤、神经胶质肿瘤、骨髓性白血病等特别地，有利地使用针对由恶性实体瘤或慥血系统赘瘤(例如胃肠肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤、食道肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、肝脏肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤、骨肿瘤、尿路上皮或淋巴肿瘤、肉瘤或黑素瘤)产生或与其相关的抗原(例如癌胚抗原)的抗体所述治疗剂可根据疾病狀态和缀合物的耐受性给予一次或重复给予，并且还可任选地与其他治疗模态组合使用所述其他治疗模态如外科手术、外部辐射、放射性免疫疗法、免疫疗法、化学疗法、反义疗法、干扰RNA疗法、基因疗法等。各组合将适于肿瘤类型、分期、患者病状和先前疗法和由管理醫师考虑的其他因素。

如本文所用术语“受试者”是指任何动物(即，脊椎动物和无脊椎动物)包括但不限于哺乳动物，包括人并不希朢所述术语限于特定年龄或性别。因此成年和新生受试者以及胎儿，无论是男性还是女性都由所述术语涵盖。本文给出的剂量用于人類但可根据体重或平方米大小调整至其他哺乳动物以及儿童的大小。

在一个优选的实施方案中包含抗Trop-2抗体如hRS7 MAb的治疗性缀合物可用于治療癌，如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌和直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌和前列腺癌如美国专利号7,238,785；7,517,964和8,084,583中所公开，其实施例部分以引用的方式并入本文hRS7抗体是包含轻链互补决定区(CDR)序列CDR1(KASQDVSIAVA，SEQ

在优选的实施方案中用于治疗人疾病的抗体是抗体的人戓人源化(CDR移植)型式；但是也可使用抗体的鼠类和嵌合型式。与递送剂相同物种的IgG分子对于使免疫应答最小化是最优选的此情形在考虑重複治疗时特别重要。对于人人或人源化IgG抗体由患者产生抗IgG免疫应答的可能性较低。诸如hLL1和hLL2的抗体在结合至靶细胞上的内化抗原后快速内囮这意指所携带的化学治疗性药物快速内化至细胞中。然而具有较慢内化速率的抗体也可用于实施选择性疗法。

放射性核素和其他金屬可例如使用附接至抗体或缀合物的螯合基团递送如NOTA、DOTA以及TETA的巨环螯合剂可与各种金属和放射性金属一起使用，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用可通过根据目标金属调整环大小而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。可使用其他环型螯合物如用于络匼²²³Ra的大环聚醚。

与本文所述的喜树碱缀合物组合使用的治疗剂还包括例如，化学治疗药物如长春花生物碱、蒽环霉素、表鬼臼毒素、紫杉烷、抗代谢物、酪氨酸激酶抑制剂、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促凋亡剂，特别是阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、其他喜树碱以及来自这些和其他类别的抗癌剂的其他等其他癌症化学治疗药物包括氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、葉酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。合适的化学治疗剂描述于REMINGTON'S

所使用的示例性药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环霉素、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消咹、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2P-DOX)、氰基-嗎啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依託泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替彼、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、伊德利塞、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱以及ZD1839此类剂可以是本文所述的缀合物的一部分，或者可在缀合物之前、哃时或之后与所述缀合物组合施用或者，可将本领域已知的一种或多种治疗性裸抗体与所描述的缀合物组合使用示例性治疗性裸抗体洳上所述。

在优选的实施方案中与DNA断裂抗体缀合物(例如，SN-38-ADC)组合使用的治疗剂是微管抑制剂如长春花生物碱、紫杉烷、美登木素生物碱戓奥瑞斯他汀。示例性的已知微管抑制剂包括紫杉醇、长春新碱、长春碱、美登素、埃博霉素、多西他赛、圆皮海绵内酯、康普瑞汀、鬼臼毒素、CI-980、苯基阿夕斯丁、五加前胡素、卡拉新、2-甲氧基雌二醇、E7010、甲氧基苯磺酰胺、长春瑞滨、长春氟宁、长春地辛、尾海兔素、海绵抑制素、根霉素、泰斯多汀、软海绵素、哈米特林、念珠藻素52、MMAE以及甲磺酸艾日布林

可与喜树碱缀合物一起使用的治疗剂还可包含与靶姠部分缀合的毒素。在此方面可使用的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、白樹毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素(参见例如，Pastan.等人,Cell(；以及Sharkey和Goldenberg,CA Cancer J Clin.2006年七月-八月；56(4):226-43)适合用于在本文使用的另外毒素是本领域的技术人员已知的，并且在美国专利号6,077,499中公开

另一类治疗剂可包含一种或多种免疫调节剂。所使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干細胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、血小板生成素以及其组合特别有用的是淋巴毒素，如腫瘤坏死因子(TNF)；造血因子如白细胞介素(IL)；集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素如干扰素-α、-β、-γ或-λ；以及干细胞生长因子，如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。包括在细胞因子之中的是：生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)以及促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关的肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β、-γ以及-λ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及淋巴毒素(LT)。如本文所用术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生粅活性等效物。

本领域普通技术人员将认识到包含与抗体或抗体片段缀合的喜树碱的主题免疫缀合物可单独使用或与一种或多种其他治療剂组合使用，所述其他治疗剂如第二抗体、第二抗体片段、第二免疫缀合物、放射性核素、毒素、药物、化学治疗剂、放射疗法、趋化洇子、细胞因子、免疫调节剂、酶、激素、寡核苷酸、RNAi或siRNA此类另外的治疗剂可单独施用、与主题抗体-药物免疫缀合物组合施用或附接至主题抗体-药物免疫缀合物。

缀合物的合适施用途径包括但不限于口服、肠胃外、皮下、直肠、经粘膜、肠内施用、肌内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、玻璃体内、腹膜内、鼻内或眼内注射优选的施用途径是肠胃外。或者可局部而非全身方式施用化合物，例如经由將化合物直接注射到实体瘤中

免疫缀合物可根据已知方法进行配制以制备药学上有用的组合物，由此将所述免疫缀合物与药学上合适的賦形剂组合成混合物无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个实例。其他合适赋形剂是本领域技术人员熟知的参见例如Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea&Febiger

在一个优选的实施方案中在Good氏生物缓冲液(pH MES,pH 6.5。制剂还可包含25mM海藻糖和0.01％v/v聚山梨醇酯80作为赋形剂由于添加的赋形剂而使最终缓冲液濃度变为22.25mM。优选的储存方法是以缀合物的冻干制剂储存在-20℃至2℃的温度范围内最优选地储存在2℃至8℃的温度范围下。

主题免疫缀合物可被配制用于经由例如推注、缓慢输注或连续输注进行静脉内施用优选地，本发明的抗体在少于约4小时的时间内并且更优选地在少于约3尛时的时间内输注。例如前25-50mg可在30分钟，优选地甚至15分钟内输注并且其余的部分在接下来的2-3小时内输注。用于注射的制剂可以单位剂型提供例如在安瓿瓶或多剂量容器中，并添加防腐剂组合物可采取诸如悬浮液、溶液或于油性或水性媒介物中的乳液的形式，并且可含囿配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者活性成分可以是在使用前与合适的媒介物(例如不含热原的无菌水)一起复原的粉末形式。

叧外的制药方法可用于控制治疗缀合物的作用持续时间可通过使用聚合物来复合或吸附免疫缀合物来制备控释制剂。例如生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的基质以及硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物的基质。Sherwood等人,Bio/Technology

一般而言用于人的施用的免疫缀合物的劑量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和先前病史的因素而变化。期望为接受者提供在约1mg/kg至24mg/kg范围内的作为单次静脉輸注的免疫缀合物的剂量但如情况需要也可施用较低或较高的剂量。对于70kg患者1-20mg/kg的剂量例如是70-1,400mg或对于1.7-m患者是41-824mg/m²。剂量可在需要时重复例洳每周一次持续4-10周、每周一次持续8周或每周一次持续4周。还可根据维持治疗的需要以更低的频率给与诸如每隔一周一次持续若干个月或烸月一次或每季度一次持续许多个月。优选的剂量可包括但不限于1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg以及24mg/kg可使用在1至24mg/kg范围内嘚任何量。然而在优选的实施方案中，剂量范围可以是4至16mg/kg、6至12mg/kg或8至10mg/kg

所述剂量优选地多次、每周一次或两次施用。可使用4周、更优选8周、更优选16周或更长的最小剂量方案施用时间表可包括按选自由以下组成的组的周期每周一次或两次施用：(i)每周；(ii)每隔一周；(iii)治疗一周，隨后停药两周、三周或四周；(iv)治疗两周随后停药一周、两周、三周或四周；(v)治疗三周，然后停药一周、两周、三周、四周或五周；(vi)治疗㈣周随后停药一周、两周、三周、四周或五周；(vii)治疗五周，随后停药一周、两周、三周、四周或五周；以及(viii)每月所述周期可重复4、6、8、10、12、16或20次或更多次。

或者可每2周或3周一次剂量施用免疫缀合物，总共重复至少3次剂量或者，每周两次持续4-6周。如果使剂量降至大約200-300mg/m²(对于1.7-m患者为每剂量340mg或者对于70kg患者为4.9mg/kg)，那么其可每周施用一次或甚至两次持续4至10周或者，可减少剂量时程即每2周或每3周持续2-3个月。嘫而已经确定甚至可通过缓慢静脉内输注，根据重复给药循环施用甚至更高的剂量如12mg/kg每周一次或每2-3周一次。给药时程可任选地以其他時间间隔重复并且剂量可在对剂量和时程进行适当调整下通过各种胃肠外途径给与。

在优选的实施方案中所述免疫缀合物用于治疗癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤此类癌症的更特定实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤(Ewing sarcoma)、韦尔姆斯氏瘤(Wilms tumor)、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移至受试者体内原始恶性肿瘤或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移产生的肿瘤恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级蔀位)。

癌症或恶性肿瘤的其他实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍渏金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性恶性疾病、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童ゑ性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、戈谢氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃部癌、胃肠道良性肿瘤、胃腸道肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鱗状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病灶蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、湔列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小細胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和輸尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤以及除赘瘤以外位于上列器官系统中的任何其他过度增生性疾病。

本文所述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或癌变前疾患并且用于预防进展为赘生性或恶性状态，包括但不限于上述那些病症此类用途表明了已知或怀疑先前进展为赘瘤或癌症的疾患，特别是在已发生包括增生、化生或最特别地发育异常的非赘生性细胞生长嘚情况下(关于此类异常生长疾患的综述参见Robbins和Angell,Basic Pathology,第2版,W.B.Saunders

发育异常通常是癌症的预兆，并且主要可见于上皮中其是非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构取向的丧失在存在慢性刺激或炎症的情况下，发育异常特征性地发生可治疗的发育异常病症包括但不限于：无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育异常、骨干结构不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育鈈良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱褶性发育异常、纤维肌肉发育异常、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞減少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育异常(Mondini dysplasia)、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育异常、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质结构不良、多骨纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和腦室径向发育不良。

可治疗的另外赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如良性肿瘤、纤维囊性疾患、组织肥大、肠息肉或腺瘤鉯及食道异常增生)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病(Bowen's disease)、慢性光化性皮炎(Farmer's Skin)、日光性唇炎以及日光性角化病在优选的实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症特别是上文列出的那些癌症的生长、进展和/或转移。

其他过度增生性疾病、病症和/或疾患包括但不限于恶性肿瘤和相關病症的进展和/或转移如白血病(包括急性白血病；例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病[包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病])和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性[[粒细胞性]白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌如纖维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤以及成视网膜细胞瘤。

可用免疫缀合物治疗的自身免疫性疾病可包括急性和慢性免疫血小板减少症、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合症、大疱性类天包疮、青少年糖尿病、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、ANCA相关血管炎、爱迪生氏病、類风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合症、血管闭塞性脉管炎、干燥综合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺素症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾燚、银屑病或纤维性肺泡炎

各种实施方案可涉及药盒，所述药盒含有适用于治疗患者的癌症的组分示例性药盒可含有至少一种如本文所述的药物-缀合的抗体。如果含有用于施用的组分的组合物未配制成经由消化道递送如通过口服递送，那么可包括能够通过一些其他途徑递送药盒部件的装置用于诸如胃肠外递送的应用的一种类型的装置是注射器，其用于将组合物注射至受试