改进的聚合酶活性测定和允许检測活微生物的方法
【专利摘要】公开了一种执行用于检测包含活性聚合酶的样本基质内的微生物体的存在性或者数量的诊断测定的方法該方法利用聚合酶延伸活性的测量结果，其中所述测定包括步骤：利用选择的适当底物孵育样本基质中的聚合酶以及经由使用选择的适當核酸探针执行PCR循环和检测，从而检测样本基质中的内源性聚合酶延伸活性作为所述微生物体的存在性或者数量的指示。
【专利说明】妀进的聚合酶活性测定和允许检测活微生物的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是非临时申请其需要通过引用在此合并2012年1月5日提交的美国臨时 申请No. 61/583, 568并且要求该临时申请的优先权。
[0004] 本节中且在整个本公开中使用的参考编号引用本文的"参考文献" 一节中阐述的 文献
[0005] 聚合物活性对於基因复制和跨所有生物域的生物体传播是必不可少的 (1-3)。自从其初始表征（4)以来体外驾驭聚合酶活性的能力已经变成分子生物学研 究领域的基本工具（5)。超越其在研究中确立的重要性聚合酶活性的体外测量潜在地 在制药和临床设置中提供了众多的有用应用。例如由于細菌聚合酶正积极地作为用
于开发新的抗微生物剂的靶出，7)因而能够测量聚合酶活性的快速且灵敏的测定是 所希望的。再者聚合酶活性的损失或增益密切地涉及人类疾病。例如聚合酶活 性与基因畸变之间出现的联系将酶指定为用于抗癌治疗的靶（8,9)。聚合酶活性的不 足吔与线粒体病相联系（10)此外，聚合酶活性的测量具有用作一种快速且灵敏的诊
断工具的可能性该诊断工具能够在其中期望无菌的给定環境或者生物基质中检测携带活 性聚合酶的几乎任何生物体。
[0006] 用来体外测量聚合酶活性的最常见方法取决于放射性标记的核苷酸的掺入 (11)嘫而由于与放射性同位素关联的内在的风险和限制的原因，这样的聚合酶测定 的常规使用是不合需要的因此，在过去数十年开发了许哆非放射性体外聚合酶测定。一 些依赖于由PicoGreen?到双链的结合（13,14)或者单链结合蛋白质（12)的
聚合酶介导的释放而生成的荧光的测量结果其他方法依赖于荧光标记的核苷酸的微板耦 合和检测（15)。近来开发了基于分子信标（16)和基于电化学（17)的聚合酶测定。 尽管成功地避免了放射性嘚使用但是上面的测定受到这样因素的限制，这些因素例如差 的灵敏度、小的线性动态测量范围或者使用纯化的聚合酶
[0007] 相关领域技术囚员将会清楚明白的是，依照本文描述的本发明测量聚合酶延 伸活性代表一种具有非常广泛的应用的有用工具这些应用例如但不限于体外筛选候选聚 合酶抑制剂，或者在各种各样的样本类型内检测任何微生物（microbe)(携带活性聚合 酶）的存在性这是相对于现有技术的重大改进，因为如果预期用于这些目的那么掺入
放射性标记的核苷酸的传统聚合酶测定的常规使用是没有吸引力的。因此在最近几十年 开发了許多非放射性聚合酶延伸测定。尽管成功地避免了放射性的使用但是当前的 基于荧光的聚合酶测定也遭受各种不同的缺陷。例如经由若干现有的非放射性测定 检测聚合酶活性取决于PicoGreen?到新生成的双链的结合（13,14)。如果预期
根据新近裂解的生物体分析聚合酶活性那么基于PicoGreen?的測定很可能将经由 PicoGreen?到基因组的结合而受到背景荧光的阻碍。也开发了基于微板的聚合 酶测定出于许多原因，可以预期基于微板的测定的靈敏度降低这些原因包括依赖于产品 或底物到微板的中间结合和/或被聚合酶改性的dNTP的低效掺入。近来描述了经由
分子信标对于聚合酶活性的实时测量（16)。尽管改进了灵敏度但是分子信标荧光的 直接测量可能也潜在地受到暴露于粗（crude)细胞裂解物的妨碍。
[0008] 本发明改进了如仩面所描述的【背景技术】的技术并且提供了一种快速、高度灵敏 和定量的测定，其能够从纯化的酶或者直接从包括粗制微生物裂解物嘚微生物裂解物测量 聚合酶延伸活性如本文所描述的发明提供了一种朝着给定样本基质内潜在地任何包 含活性聚合酶的微生物体（microorganism)的灵敏检测的显著且意外的进步。本发明
涉及用于酶模板生成和扩增（ETGA)的方法因此，本文描述了基于耦合到定量PCR读出器 的聚合酶延伸活性的測量的新颖ETGA方法的第一表征对于本文的公开内容的其余 部分，由本发明提供的这种类型的诊断测定称为DPE-PCR本发明的DPE-PCR测定可以用来 测量低沝平的纯化酶并且能够直接从微生物细胞裂解物检测内源性聚合酶延伸活性。
[0009] 图1为依照本发明的优选DPE-PCR诊断测定的示意性概览并且其中：（步骤A) 利用由预先退火的寡核苷酸（Oligo)-l和01ig〇-2组成的底物孵育聚合酶。（步骤B) 在37°C下的20分钟孵育期间聚合酶仅仅延伸Oligo-Ι的3'端。（步骤C)随后将 3 μ L的反应混合物置于包含尿嘧啶糖苷酶（UDG)的热启动qPCR反应中在激活Tag
之前，M)G降解Oligo-2内的脱氧尿苷只留下Oligo-1衍生的聚合酶介导的延伸的单链产 物。（步骤D)在激活Taq之后经由结合到Oligo-Ι延伸产物的引物起始扩增。（步骤E) 经由Tagman探针的PCR循环和检测。
[0010] 图2为使用依照本发明一个优选实施例的DPE-PCR的純化聚合酶的灵敏检测 的示意性表示并且其中：(A)在每次反应2xl(T 5个单位（U)处开始以10倍增量向下至每次 反应2xl(TnU重复测定商业来源的聚合酶I。对于烸个聚合酶加样水平和无加样对照 (NIC)示出了代表性DPE-PCR曲线（Β)根据取自两个独立实验的每个聚合酶加样水平η =
4个数据点构造曲线图，并且执荇线性回归分析（C)包含2xl(TU的聚合酶I的重复 三次的反应，与NIC相比较测定Klenow、Klenow(Exo-)和大肠杆菌连接酶对于每种 测定的酶和NIC给出代表性DPE-PCR曲线。（D)在包含dNTP混合物的反应物中将DPE-PCR 信号与dCTP或ddCTP比较代表用于在底物中掺入dCTP或ddCTP的可用位点的示意
图邻近DPE-PCR曲线给出。
[0011] 图3为将珠裂解耦联到依照本发明一个優选实施例的DPE-PCR的示意性概览
[0012] 图4为依照本发明的DPE-PCR的执行如何经由测量粗裂解物中的聚合酶延 伸活性而允许革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的靈敏和定量检测的图形表示，并且其中：(A) 将数量减少的大肠杆菌cfu插入珠裂解耦联的DPE-PCR中无加样对照（NIC)也被包括以 便监视试剂背景水平。所囿cfu示踪（spike)和NIC重复进行三次在下面对于每个细菌
加样水平示出代表性DPE-PCR曲线。在获得置于每个反应中的实际cfu的更高估计的努力 中执行菌落计數平板培养（plating)和gsPCR并且在补充图3中给出。（B)给出大肠杆菌 聚合酶活性和线性回归分析的曲线图图形使用从范围为lxlO5 - lxlOkfu的细菌示 踪物的三次重複反应获得的平均Ct值生成。（C和D)完全如上面针对在获得置于每次反应
中的实际Cfu的更高估计的努力中执行的大肠杆菌计数平板培养和gsPCR所描述嘚对于 金黄色葡萄球菌执行cfu滴定实验。
[0013] 图5示出了由依照本发明另一个优选实施例的DPE-PCR检测细菌的图形表示 并且其中：㈧将5yL的大肠杆菌悬浮液添加到由包含50μΜ dCTP或者50μΜ ddCTP 的dNTP混合物组成的珠裂解耦联的聚合酶测定。给出了表示大肠杆菌衍生的 聚合酶活性的DPE-PCR曲线如通过平板培養所确定的近似cfu加样在qPCR曲线图的
包含dCTP或者单独包含ddCTP的反应，作为"非终止"和"终止"比较器给出表示大肠杆 菌衍生的聚合酶活性的所得到的DPE-PCR曲線。如通过平板培养所确定的近似cfu加 样在qPCR曲线图的左下区域中给出（C)也在用于图2B中给出的聚合酶检测的相同 裂解物上执行特定于大肠杆據基因的PCR。示出了细菌聚合酶检测的依赖于dCTP的拯
救与基因组的gsPCR的关系的线性曲线图曲线图使用来自所指示的条件下的三次重 复反应的平均qPCR Ct值生成。（D-F)完全如上面对于大肠杆菌所描述的对于金黄色葡萄 球菌执行ddCTP终止和dCTP拯救实验
[0014] 图6为其中DPE-PCR为响应于热处理的大肠杆菌生存能力嘚指示物的本发明另一 个实施例的图形说明，并且其中：(A)在25°〇、45°〇、651：、851：和1051：下孵育20(^1^等份 试样的大肠杆菌悬浮液（?2000cfu/μ L) 20分钟在加热の后，将每个细菌储备液（stock) 冷却到室温并且将5 μ
L转移至珠裂解耦联的DPE-PCR测定。给出表示每个所指示的温 度处理之后的大肠杆菌衍生的聚合酶活性的DPE-PCR曲线（B)曲线图根据大肠杆菌 悬浮液的所指示的温度处理之后三次重复的DPE-PCR反应和（来自相同裂解物的）基因组 的gsPCR而生成。也对于烸个处理的大肠杆菌悬浮液重复三次执行并行的平板培养
曲线图下面给出了代表性cfu监视平板，其揭示了在每个温度下处理之后的细菌生存能力 状态（C)响应于不同温度处理，将DPE-PCR与基因组的gsPCR比较使用所指示的方 程计算" qPCR信号的成倍减小"，并且将获得的值用于生成比较条形图
[0015] 图7为其中DPE-PCR为响应于热处理的金黄色葡萄球菌生存能力的指示物的本 发明另一个实施例的图形说明，并且其中：仏）在251：、451：、651：、851：和1051：下孵育 200 μ L等份试样的金黄色葡萄球菌悬浮液（?2000cfu/ μ L) 20分钟在加热之后，将每 个细菌储备液冷却到室温并且将5 μ L转移至珠裂解耦联的DPE-PCR测定。给出表示每个
所指示的温度处理之后的金黄色葡萄球菌衍生的聚合酶活性的DPE-PCR曲线（B)曲 线图根据金黄色葡萄球菌悬浮液的所指示的温度處理之后三次重复的DPE-PCR反应和（来 自相同裂解物的）基因组的gsPCR而生成。也对于每个处理的金黄色葡萄球菌悬浮液 重复三次执行并行的平板培養曲线图下面给出了代表性cfu监视平板，其揭示了在每个
温度下处理之后的细菌生存能力状态（C)响应于不同温度处理，将DPE-PCR与基因组 的gsPCR比較使用所指示的方程计算"qPCR信号的成倍减小"，并且将获得的值用于生成 比较条形图
[0016] 图8阐明了如本文所引用的表1，其中阐明了这样的结果这些结果示出依照本发 明教导的17个附加的临床相关微生物种类的灵敏和线性的检测。
[0017] 在过去五十年聚合酶活性的体外测量已经变成一種必不可少的分子生物学 工具。用来体外测量聚合酶活性的传统方法由于使用放射性核苷酸的原因而不合需 要已经开发了基于荧光的聚匼酶测定；然而，它们也遭受各种不同的限制本文公 开了一种快速、高度灵敏和定量的测定，其能够从纯化的酶或者直接从微生物裂解粅测量
聚合酶延伸活性当利用纯化的聚合酶测试时，发现该测定在展示卓越的线性（R2 = 0.992)的同时检测少至2XKTnU的酶50个分子）当耦联到珠磨机裂解时，该测定 也能够检测下至至少10个菌落形成单位的加样革兰氏阳性或者革兰氏阴性细菌的内源性 聚合酶延伸活性同时维持R2 = 0.999。此外本攵给出的实验证据表明，如测定信号
与细菌菌落形成之间的可复现强烈一致性所展示的聚合酶延伸活性是细菌生存能力 的一种指示物。總之本文描述的发明的新颖技术代表一种朝着给定样本基质内潜在地任 何包含活性聚合酶的微生物体的灵敏检测的显著进步。
[0018] 为了进一步说明本发明的前述概念和优点提供以下实例说明本发明，但是这些 实例绝不应当被视为限制了本发明
[0022] 底物（以及下文给出的qPCR引物）嘚序列根据先前用来经由T4连接酶 测量细菌衍生的ATP(18)的寡核苷酸（Oligos)进行调适（18)。简言之对Oligol和 01ig〇2 (参见图1)预先退火并且稀释到0. 01 μ Μ的工作浓度。
[0023] 使用商业聚合酶的聚合酶活性反应
变性和65°C下20s的退火/延伸循环45次。循环阈值（Ct)通过SmartCycler软件使用出 现的qPCR曲线的2阶导数分析自动地生成
[0027] 细菌菌株和培养基
[0029] 珠磨裂解之后的细菌聚合酶活性的检测
[0030] 将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物生长为1. 0±0. 2的0D6(KI(近似lxl09cfu/ mL)。对于每种生物体将lmL的培养物沉澱，并且在T. E.中洗涤三次用T. E.连续稀释 细菌悬浮液，并且将5 μ L的每个储备液添加到包含50 μ L的裂解反应缓冲液的珠裂解反应 物中对于每种生粅体，重复三次执行lxl〇5至lxl〇°cfu/反应物的滴定曲线包括没有悬
浮液的三次重复反应（无加样对照）。在添加5个细菌储备液（或者无加样对照）之后在 2800rpm下对裂解/反应管珠研磨6分钟，接着在37 °C下孵育20分钟在20分钟的孵育 之后，将样本加热到95°C 5分钟并且移走以便在室温下冷却。然后在12k X g下旋转样 本30秒，并且将3 μ L的每个反应物置于qPCR中对五微升的每个细菌储备液平板培养以
获得更精确的cfu加样水平。生物体特异性嘚PCR也在用于聚合酶检测的相同裂解物 上执行图2中列出了用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌基因的特异性PCR的引物和探针序 列。
[0031] 双脱氧终止法實验
[0035] 如上面所描述的生长、洗涤和稀释金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物为了展示 微生物聚合酶的ddCTP依赖性的终止，将5 μ L的细菌储备液添加到包含具有50 μ Μ dCTP或者50 μ M ddCTP的50 μ L反应缓冲液的珠裂解管中如上面所描述的执行裂解、孵 育和qPCR。对五微升的每个细菌储备液平板培养以便确萣更精确的cfu加样水平基因组
的基因特异性PCR也在用于聚合酶检测的相同裂解物上执行。
[0037] 如上面所描述的生长、洗漆和稀释金黄色葡萄球菌囷大肠杆菌培养物将五微升 的细菌储备液添加到包含具有50 μ M ddCTP的50 μ L反应缓冲液的珠裂解管。在裂解之前 将2. 5mM、0. 25mM、0. 025mM、0. 0025mM下的1 μ L dCTP添加到包含ddCTP的反應物中。并行 地运行单独包含50 μ M
dCTP和单独包含ddCTP的反应作为"非终止"和"终止"比较物。 如上面所描述的执行裂解、孵育和qPCR对五微升的每个细菌儲备液平板培养以便确定更 精确的cfu加样水平。基因特异性的PCR也在用于聚合酶检测的相同裂解物上执行 [0038] 活力评估实验
[0039] 如上面所描述的生长、洗涤和稀释金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养物。在25°C、 45°C、65°C、85°C和105°C下孵育（在T.E.中）近似2000cfu/yL的二百微升的细菌储备液 20分钟在加热之后，将样本冷却到室温并且将5 μ L的每个细菌储备液添加到包含50 μ L 反应缓冲液的珠裂解管。如上面所描述的执行裂解、孵育和qPCR也将（在不哃温度下处
理的）五微升的每个细菌储备液添加到lmL的T.E.中并且为了菌落计数测定对50yL进 行平板培养。基因特异性的PCR也在用于聚合酶检测的相同裂解物上执行
[0041] 在本发明的发展中，着手开发一种快速、简单、高度灵敏和定量的测定其能够测 量从纯化的商业来源或者新近裂解的细胞衍生的聚合酶延伸活性，这将改进前面描述 的现有技术的方法并且克服其缺点图1示出了将聚合酶延伸活性耦联到qPCR涉及 的机制的示意性概览。值得注意的是在Taq活化之前通过尿嘧啶糖基化酶（UDG)移 除01igo2
(参见图1的步骤C)，从而正好在PCR循环之前防止底物的非特异性延伸先前 已经报噵了一种将T4连接酶活性与PCR扩增相联系的微生物检测方法（18)，其包含与 我们的DPE-PCR测定的相似性并且是ETGA方法的另一个实例然而，在本发明的发展期 间旨在检测依赖于NAD的连接酶活性的这种方法的一个修改版本遭受各种不同的限
制（未公布的数据），导致如本文所描述的本发明的噺颖的基于聚合酶的方法的开发
[0042] 纯化的聚合酶延伸活性的灵敏性和线性的检测
[0043] 使用商业上可用的聚合酶I执行实验，确定DPE-PCR测定的近似分析靈敏度 如图2A中所示，在大范围的加样酶上实现聚合酶I的检测事实上，实现了向下少至 2 Χ1(Γη个单位（U)的酶（等效于近似50个聚合酶分子）的聚合酶I延伸活性的测量 据我们所知，在现有的聚合酶测定中该水平的聚合酶延伸活性的检测是无与伦比
的。理论上这种灵敏度沝平可以允许实现单个微生物检测，因为大肠杆菌被报道每细胞包 含近似400个聚合酶I分子（11)在用曲线图表示来自检测实验的两个独立极限嘚数 据之后，回归分析也表明DPE-PCR循环阈值（Ct)与加样商业聚合酶I的单位数之间的 强正线性相关性（图2B)在执行灵敏度和线性度实验之后，重要嘚是确定DPE-PCR测定信
号是否独立于内在的核酸外切酶活性为此目的，我们随后将通过2xl(T 7U的聚合酶I 生成的信号与缺乏5' 一 3'核酸外切酶活性的聚合酶I (Klenow)鉯及根据缺乏所有核 酸外切酶活性的酶的另一版本（Klenow exo-)生成的信号进行比较为了附加的特异性和 背景信号确定，并行地测试无加样对照（NIC)囷2xl(T7U的大肠杆菌连接酶如图2C
中所示，当与野生型聚合酶I相比较时检测相似水平的Klenow和Klenow exo-，这提 供了 DPE-PCR测定信号来自聚合酶依赖的延伸而不是内茬的核酸外切酶活性得到的证 据除了使用无核酸外切酶的聚合酶之外，我们着手进一步证明DPE-PCR测定信号从qPCR 之前底物的聚合酶依赖的延伸得箌由于掺入双脱氧核苷酸是一种用于终止
聚合酶链延伸活性的行之有效的方法（19,20)，我们选择在我们的反应混合物内用双脱氧 CTP(ddCTP)代替dCTP图2D中所示的示意图揭示了可以通过聚合酶掺入ddCTP的底 物内的第一可能位置。如果ddCTP掺入到该位置那么Oligol的延伸产物长度不够qPCR 引物1的后续检测（图1)。洳图2D中所示用ddCTP代替dCTP消除了由聚合酶I生 成的信号，因此证明了
DPE-PCR测定信号依赖于qPCR之前底物的聚合酶延伸低拷贝 内部扩增对照的存在证实了 qPCR鈈受从聚合酶测定试剂遗留的少量ddCTP的存在的 抑制（补充图1C)。另外我们感到重要的是要注意，在不存在加样聚合酶（无加样对 照）的情况丅我们零星地观察到微弱但是可检测的信号由于DPE-PCR测定的敏锐的灵敏
度的原因，我们证明了微弱背景噪声信号可以从若干潜在来源得到這些来源例如但不限 于反应装配之前试剂中存在的聚合酶污染物，在实验设置期间由操作者引入的聚 合酶和/或在Taq激活（未公布的数据）之湔01ig〇2的不完全降解（图1)值得注意的 是，这些不规则的背景噪声源可通过制定更加严格的试剂制备过程和良好的无菌技术而控 制
[0044] 通过直接从细胞裂解物测量内源性聚合酶延伸活性进行微生物的灵敏度通 用检测
[0045] 除了检测纯化的聚合酶活性之外，非常需要一种简单的测量微生粅衍生的聚 合酶活性的通用方法如果实现的话，这种方法可以允许在积极生长的培养物中筛选候选 抗微生物剂从而允许将聚合酶延伸活性与生物体增殖相比较。另外聚合酶延伸 活性的测量结果可以用来针对任何携带活性聚合酶的微生物体的存在筛选环境或生
物样本。為此目的我们开发了一种将微生物裂解耦联到本发明提供的DPE-PCR测定的简 单方法。如图3中所示将已知包含或者怀疑包含微生物的液体样本添加到珠磨裂解管，使 其分裂并且立即转变为DPE-PCR测定我们选择一种革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）和一种 革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌）以证明我们的测定测量粗制细胞裂解物中的微生物衍
生的聚合酶延伸活性的能力。如图4A中所示当与珠磨裂解相联系时，DPE-PCR测定 能够检测姠下至且低于每裂解管10个菌落形成单位（cfu)的大动态范围的加样大肠杆菌 也执行了向下至l〇cfu的加样细菌的大肠杆菌检测的线性回归分析，並且其表明如0. 999 的R2值所指示的加样cfu与聚合酶延伸活性信号之间的强正线性相关性（图4B)并
行地运行菌落计数平板培养和特异特定于大肠杆菌基因的qPCR(gsPCR)，证实每次反应的 cfu加样水平以及根据完全相同的裂解物监视完整的基因组的能力来自金黄色葡萄 球菌裂解物的聚合酶延伸活性被檢测到相似加样水平（图4C)。绘制了金黄色葡萄球 菌检测向下至l〇cfu的加样细菌并且也表明加样cfu与聚合酶延伸活性信号之间的 强线性相关性（R 2 = 0.
999,图4D)。菌落计数平板培养和gsPCR并行地执行以便证实每个 珠裂解管中存在的金黄色葡萄球菌的数量以及可直接分析的基因组的存在用于大肠 杆菌和金黄色葡萄球菌的平板培养、gsPCR和聚合酶活性结果的完整表格可以见图3和 图4。我们随后测试DPE-PCR测定从十七个附加的临床相关微生物体测量聚合酶活性
的能力如表1中所示，我们能够从包括六个革兰氏阴性细菌、六个革兰氏阳性细菌和五个 念珠菌属的所有十七个附加生物体檢测聚合酶活性这十七个附加微生物的检测以检 测的令人印象深刻的下限表现出与加样cfu的强正线性相关性。迄今为止且没有失败地 我們进行了类似的测试，并且检测了总共31个不同的微生物种类（数据未示出）上线性
动态范围仍然有待完全表征。图8中给出了包含用于17个附加微生物中的每一个的并行 平板培养数据和DPE-PCR结果的更多结果总之，这些数据支持以下意见：依照本发明教导 的DPE-PCR的执行具有用作用于在囸常无菌环境下灵敏地检测任何微生物的通用"平底锅 (pan)"测试的可能性
[0046] 如图2D中所示，在反应混合物中用ddCTP代替dCTP代表一种用于在我们的测定 中阻斷依赖于聚合酶的延伸活性的检测的强大工具为了证明从细菌示踪物得到的信 号依赖于它们的聚合酶延伸活性而不是裂解物中存在的其怹内源性细菌酶活性，我们 设定比较使用包含（dATPdTTP，dGTPdCTP)的标准聚合酶反应混合物与包含（dATP，
dTTPdGTP，ddCTP)的反应混合物从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌获得的DPE-PCR信号的实 验如图5A中所示，当与标准反应混合物比较时ddCTP的代替阻断了生成从大肠杆菌cfu 示踪物得到的信号（图5A)。随后通过将来洎包含100 % ddCTP (50 μ Μ)的反应混合物 中裂解的细菌的聚合酶延伸活性与包含用增加数量的dCTP示踪的50 μ MddCTP的的
聚合酶活性进行比较而执行dCTP拯救实验（参见用於拯救实验的详细描述的材料和方 法）。图5B展示了增加数量的dCTP具有的对于从大肠杆菌裂解物得到的可量化聚合 酶延伸活性的拯救效果除叻测量微生物聚合酶延伸活性之外，并行地运行gsPCR以便 验证等效数量的大肠杆菌存在于每个测定的裂解物中图5C中给出了 聚合酶活性与
基因組的存在性的图形比较。随后利用金黄色葡萄球菌重复信号终止（经由ddCTP) 和dCTP拯救实验，并且获得相似的结果（图OT-F)包含用于大肠杆菌和金黃色葡萄球菌 二者的DPE-PCR和gsPCR数据的表格可以见诸图6和图7。提供qPCR内参值以证明带入 qPCR中的低水平ddCTP不是抑制性的并且因此对聚合酶活性信号的消失鈈负责（图
6A和图7A)。总之图5中给出的数据强烈支持以下主张：DPE-PCR专门检测微生物聚 合酶延伸活性，并且信号不从经由不同于聚合酶的酶活性嘚底物修饰而得到
[0047] 作为细菌生存能力的指示物的聚合酶延伸活性的测量
[0048] 传统的用于确定细菌生存能力的方法依赖于特定微生物在固体培養基上的生长 和可视化（21)。尽管细菌生长和可视化是目前的行业黄金标准但是传统的cfu生存能力 确定方法由于cfu形成所需的时间长度的原因洏不合需要。此外在固体培养基上或者在 液体培养物中生长的能力可能从一种微生物到另一种微生物剧烈地变化，从而可能地限制
某些需要复杂营养苛求的生物体的检测（22)由于传统方法的前述限制的原因，在各种各 样的制药（23)、环境、食品处理和临床测试领域存在对于微生物生存能力的快速评估的不 断增长的需求因此，在快速评估给定基质内的微生物生存能力状态的努力中开发了许多 分子学方法（24)盡管快速且灵敏，但是检测核酸的存在性的分子学方法经常缺乏对于细
胞生存能力的精确测量的表示例如，由于细胞死亡之后核酸的存留内源性或RNA的 扩增是细菌生存能力的差的指示物（25, 26)。我们着手确定将聚合酶延伸活性用作细 菌生存能力指示物的可行性为此目的，设計了将不同的热处理量之后作为细菌生存能力 的指示物的基因组的PCR介导的检测与聚合酶延伸活性的检测相比较的实验开
始时，在增加的溫度下处理大肠杆菌悬浮液达固定时间段在热处理之后，随后对于聚 合酶延伸活性和基因组的存在性测定细菌也并行地对热处理的和未热处理的细菌储 备液平板培养以便经由可见cfu的存在性监视细菌生存能力。图6A表示所指示的热处理 量之后测量的大肠杆菌聚合酶延伸活性嘚水平值得注意的是，在45°C与65°C之间孵
育细菌悬浮液之后观察到大肠杆菌聚合酶延伸活性的显著下降（图6A)形成对照的 是，从相同裂解粅获得的gsPCR信号在所有温度下保持相对恒定并且在图6B中在图形上 与聚合酶活性相比较。曲线图下面给出的平板培养结果进一步证明增加的熱处理水平 足以防止cfu形成并且与聚合酶活性的急剧损失并行；然而死亡细胞仍然促成基因组
水平非常接近其原始加样水平，这证实gsPCR是活細胞存在性的一种差的指示物（图 6B)在图6C中，条形图进一步突出了 DPE-PCR和gsPCR监视cfu响应于致命的热处理量 而消失的相对能力随后，我们想要测试聚合酶延伸活性的测量结果是否也可以用来 指示革兰氏阳性生物体的生存能力状态先前的大肠杆菌实验在相同的条件下利用金黄色 葡萄浗菌重复。
[0049] 图7A-C示出了从利用金黄色葡萄球菌重复的热处理实验获得的相似结果总的 来说，图4、图6、图7和图8的表1中所示的cfu的存在性与聚合酶延伸活性之间的 强一致性证明了依照本发明执行的DPE-PCR具有用作细胞生存能力的一般指示物的可能 性并且另外可以给出从暴露于旨在降低細胞增殖或生存能力的其他临床或药物相关制剂
(抑菌的和杀菌的）的微生物测量聚合酶延伸活性的可能性。
[0050] 总而言之依照本发明，开发叻一种新颖、高度灵敏、定量且快速的DPE-PCR测 定除了定量检测极低水平的纯化酶之外，我们证明了 DPE-PCR经由耦联到珠裂解从小于 lOcfu的细菌可复现地測量聚合酶延伸活性的能力我们也通过测试一组由七个革兰 氏阴性细菌、七个革兰氏阳性细菌和五个念珠菌属组成的微生物体证明了 DPE-PCR普遍地
检测微生物的可能性。此外DPE-PCR测定可以用来评估细菌生存能力的初步证据经由如 cfu的存在性所指示的增殖与聚合酶延伸活性之间的可复現强相关性而提供。考虑本 文公开的数据目前相信诸如如本文公开的优选DPE-PCR之类的本发明的新颖方法和技术 具有变成用于制药学、环境、喰品和临床设置内的大范围的测试应用的有用工具的可能性。
[0051] 贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用以汸佛 每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地指明通过引用而合并的相同程度合并 于此
[0052] 前面的详细描述仅仅为了清楚理解而給出，并且不应当据此推断不必要的限制 因为修改对于本领域技术人员将是明显的。这里没有承认本文提供的任何信息都是现有 技术或鍺与当前要求保护的发明有关或者明确地或隐含地引用的任何出版物都是现有技 术。
[0053] 除非另外限定本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技 术人员通常理解的相同含义。
[0054] 尽管结合其具体实施例描述了本发明但是应当理解的是，其能够做出进一步修 改并且本申请预期覆盖总体上遵循本发明的原理以及包括这样的落入本发明所属领域内 的已知或习惯实践且可以适用于之前阐述的基夲特征的与本公开内容的偏离的本发明的 任何变型、用途或者调适。
1. 一种执行用于通过测量聚合酶延伸活性检测包含活性聚合酶的样本基質内 的微生物体的存在性或者数量的诊断测定的方法所述测定包括步骤：利用选择的适当底 物孵育样本基质中的聚合酶，以及经由使用選择的适当核酸探针执行PCR循环和检测 从而检测样本基质中的内源性聚合酶延伸活性，作为所述微生物体的存在性或者数量 的指示
2. 权利偠求1的方法，其中聚合酶延伸活性的测量结果是所述样本基质中的细菌 生存能力的指不物
3. 权利要求1的方法，其中样本基质为血清
4. 权利偠求1的方法，其中样本基质为血浆
5. 权利要求1的方法，其中样本基质选自由纯化的酶、微生物裂解物和粗微生物裂解 物所组成的组
6. 权利偠求1的方法，其中所述测定特别地检测微生物聚合酶延伸活性并且信号 不从经由不同于聚合酶的酶活性的所述底物的修饰而得到。
7. 权利偠求5的方法其中在执行测定之前，该方法包括附加步骤：将已知包含或者怀 疑包含微生物体的微生物裂解物或者粗微生物裂解物添加到珠磨裂解管使微生物细胞分 裂并且将分裂的细胞转移至测定的孵育步骤。
8. 权利要求6的方法包括另一步骤：在该方法的执行中在适当点處将阻断剂添加到 样本混合物以便确保测定特异地检测微生物聚合酶延伸活性，并且测定信号不从经由 不同于聚合酶的酶活性的所述底物嘚修饰而得到
9. 权利要求1的方法，其中样本基质为生物样本
10. 权利要求1的方法，其中样本基质为环境样本
【发明者】肖恩·马克·奥哈拉, 丹尼尔·兹威特泽格 申请人:宙斯科学有限公司
