抽提提取质粒溶液I 溶液II 溶液III作用的时候为什么要加NaOH?

质粒dna的提取是DNA技术中的*实验技能。质粒DNA上携带的基因信息可经过基因表达实验后表现出相应的性状。质粒DNA的分离提取包括了培养细胞——收集——分离纯化三大步骤。质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外,质粒dna上携带了部分的基因信息,经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主细胞中提取质粒DNA,是DNA重组技术中zui基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤:1、培养细菌使质粒扩增2、收集和裂解细菌3、分离和纯化质粒DNA碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高,适合于大多数的和菌株,所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同,变性时前者虽然两条链分离,但仍然缠绕在一起不分开;而后者*变性分,甚至出现断裂。因此,当加入中和液时,溶液Ph值恢复较低的近中性水平,此时, 质粒的两条小分子单链可迅速复性,恢复双链结构,但是主染色体DNA则无法复性。在离心时,大部分主染色体与细胞碎片,杂质等缠绕一起被沉淀,而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒DNA链发生断裂。所以,多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:共价闭合环状DNA(cccDNA): 质粒的两条链没有断裂;超螺旋开环DNA(ocDNA): 质粒的一条链断裂;松弛的环状分子线形DNA(lDNA): 质粒的两条链均断裂;线性分子
质粒DNA的分子构型
质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图
(a)松弛线性的DNA;
(b)松弛开环的OC构型;
(c)超螺旋的SC构型
由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭,因此,在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。
(a)道中的SC DNA走在zui前沿,OC DNA则位于凝胶的zui后边;
(b)道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的,它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间
三、材料、试剂及器具1、材料E.coliDH 5α(pUC 19 vector)2、试剂1)LB培养基2)TE缓冲液3)裂解液:溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ4)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)5)无水乙醇6)70%乙醇7)氨苄50mg/mL器具离心机、离心管、吸嘴四、操作步骤以1%比例把E.coliDH5α(含PUC18)接种于含氨苄(Amp)100μg/ml)的LB培养基中37℃振摇过夜(12-18h)↓取1.5ml培养物置离心管中↓10000rpm,离心1min,或4000rpm,离心5-10min↓去上清,倒扣干净吸收纸上吸干↓沉淀+100μL溶液Ⅰ↓加或不加入少量粉末;混匀,室温放置10min↓+加200μL溶液Ⅱ(新鲜配置)↓温和颠倒数次,混匀,冰上放置5min↓+150μl溶液Ⅲ→颠倒混匀,冰上放置15min↓离心12000rpm,15min↓上清液+等体积酚:氯仿:异戊醇振匀,12000rpm,离心5min↓小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质↓上清液+2倍体积无水乙醇混匀,室温5min-10min↓12000rpm,5min-15min↓弃上清沉淀+1mL70%乙醇↓12000rpm离心5min-15min↓弃上清;并倒扣离心管使液体流干↓+自然干燥或真空抽干(看不到液滴为宜)↓加50μlTE缓冲液(20μg/mlRNaseA)溶解质粒粗取物↓-20℃保存六、实验报告检查、保存提取的质粒,要求记录实验现象并说明原因。七、思考题分析以下试剂的作用原理:溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0)10mmol/L EDTA(PH8.0)溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH2% SDS使用前新鲜配制溶液Ⅲ:5mol/L Kac 60 mL冰醋酸11.5 mL水28.5 mLRNase A酶:将粉末溶于10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L NACL中,配成10 mg/mL浓度的酶液,于100℃水浴加热15 min,缓慢冷却至室温,-20℃保存氯仿无水乙醇附注:1.溶液Ⅰ---溶菌液:它是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用。当溶液中PH小于8时,作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械切力作用降解。EDTA的作用:(1)螯合Mg2+ 、Ca2+ 等金属离子,抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时一定的金属离子作辅基)。(2)EDTA的存在,有利于的作用,因为的反应要求有较低的离子强度的环境。2.溶液Ⅱ--NaOH-SDS液:NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是稳定的。但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时,该系统的PH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3…R┿-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。3.溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc(pH4.8)溶液NaAc的水溶液呈碱性,为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液。用PH4.8的NaAc溶液是为了反pH12.6的抽提液,调回PH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在。而高盐的3MOL/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更*。4.为什么用无水乙醇沉淀DNA?用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中zui常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的zui终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代懈水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,zui后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。5.在用无水乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAC或NaCL至zui终浓度达0.1-0.25MOL/L?在Ph为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAC或NaCL,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不*,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与Kac来处理?加进去的Rnaese本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加Kac使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加*。也可用饱和酚,氯仿抽提再沉淀,去除Rnese。在溶液中,有人以Kac代替NaAc,也可以收到较好的效果。7.为什么在保存或抽提DNA过程中,一般采用TE缓冲液?在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围,可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2 产生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH /Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。8.如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%。本实验选择性沉淀4.3Kb的pBR322质粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其zui终PEG浓度为12%。PEG选择性沉淀DNA的分辩率大约100bp。9.抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去使蛋白失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在zui下层。作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水想有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果。经酚*次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。10.为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容光焕发器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戌醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戌醇为24:1之比。也可以采用酚,氯仿与异戌醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互异戌醇即成,)节同时异戌醇有助于分相,使离必后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。11.为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?因为酚与水有一定的互溶。用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失。用Tris调节至PH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下(PH5~7),RNA比DNA更容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品。保存在冰箱中的酚,容易被空气氧公而变成粉红色的,这样的酚容易降解DNA,一般不可以使用。为了防止酚的氧化,可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%。8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性,它是金属离子的弱螯合剂。用Tris PH8.0水溶液饱和后的酚,分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液,隔绝空气,以装满盖紧盖子这宜,如有可能,可充氮气,防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中,使用时,打开盖子吸取后迅速加盖,这样可使酚不变质,可用数月。碱裂解法是zui常用的质粒DNA提取方法。此实验过程中所涉及到的试剂都大有学问:例如TE缓冲液有利质粒DNA性状稳定,无水乙醇不与核酸发生反应,是保存DNA*试剂等等。想了解更多请看上面的11个问题。
一、质粒DNA的提取及鉴定(一)质粒DNA的提取及鉴定1.(1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中,接入一单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。(2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中,用台式离心机于4℃以12000g离心5min,将剩余的培养物贮存于4℃。(3)吸尽培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。2.碱裂解法小量抽提质粒(1)将细菌沉淀[上述步骤(3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/lTris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中,剧烈振荡。(2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS),缓和振荡,水浴5min。(3)加150μl预冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml),缓和振荡,冰浴5min。(4)4℃以12000g离心5min,将上清转移到另一离心管中。(5)可作不可作:加等量饱和酚,氯仿,振荡混匀,重复2,(4)。(6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA,振荡混合,于室温放置2min。(7)4℃以12000g离心5min。(8)小心吸尽上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,再将附于管壁的液滴除尽。(9)用75%乙醇于4℃洗涤DNA,同上离心去上清真空抽干。(10)加50μl的1×TE(含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶),振荡,贮存于-20℃。(二)质粒DNA的大量制备(1)同上1.(1)(2)将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中,37℃振荡培养至A590=1.0(5~6h)。(3)加氯霉素(170μg/ml)扩增,37℃温箱中培养过夜。(4)收集菌液于离心管中,冰浴10min。3000rpm,离心10min,去上清。(5)加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体,将悬液倒入高速离心管中,摇匀,冰浴5min。(6)加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀,室温下5min。(7)加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀,冰浴30min。15000rpm,4℃离心20min。(8)取上清液于高速离心管中,加2倍体积的无水乙醇,混匀,入-20℃3~5h。(9)15000rpm4℃ 离心20min。(10)弃上清,将离心管倒放入真空泵中抽干(10~15min)。(11)用5ml1×TE溶解,加入RNase A 15~20μl,42℃水浴4h于过夜。(12)加入5ml饱和酚,混匀,4000~5000rpm离心5min,取上清液入5ml离心管内。(13)分别加入2.5ml饱和酚,2.5ml氯仿,混匀后同样离心收集上清。(14)加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀,同样离心收集上清。(15)加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3~5h。(16)10000rpm4℃离心20min。(17)弃上清,加入75%乙醇洗涤2次。(18)离心弃上清,真空抽干,加入适量1×TE溶解质粒DNA。(三)质粒DNA的鉴定1.酶切反应(1)在0.5mlEppendorf管中加重蒸水6μl,10×Buffer1μl,DNA 2μl,酶1μl,混匀,37℃水浴1h以上。(2)取反应物点样,观察酶切效果。(3)酶切完全后,70℃5min终止反应。2.琼脂糖电泳(1)配制所需浓度琼脂糖凝胶。(2)在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂,混匀后点样。(3)打开电源开关,5V/cm电泳。(4)在UV灯下观察电泳结果。二、DNA的重组(一)DNA的酶切与连接(1)酶切反应同质粒DNA的鉴定,只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切,则成比例增加。(2)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀,-20℃2h以上。(3)15000rpm离心15min,弃上清。(4)加入75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。(5)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。(6)测定DNA的含量。(7)加入线性载体DNA和含量3~4倍于载体的待插入DNA片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl,在12~14℃反应12~16h。(8)连接反应液可置-20℃保存,供转化用。(9)关于待插入DNA片段的获得参见附注。(二)大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化1.感受态的制备(1)接种单菌落于2mlLB培养液中, 37℃过夜。(2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中,37℃振摇4~6h至A590=0.4~0.6。(3)倒入50ml管内,水浴10min,以2500~3000rpm离心5min,弃上清。(4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体,冰浴20min,同上离心弃上清。(5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中,每管200μl,冰浴1~2h。2.重组DNA的转化(1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记,然后按下述进行:转化项目
受体菌
DNA
总体积
DNA对照组
10μl
200μl
受体菌对照组
200μl
200μl
转化组
190μl
10μl
200μl
(2)冰浴30min至1h。中间摇动3次,以防受体菌沉底。(3)42℃90s。(4)37℃水浴5min。(5)加入无相应抗生素的Lb200μl,混匀后,37℃水浴30~60min。(6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布,室温下干燥,然后倒置于37℃温箱中培养过夜。(三)转化子DNA的快速鉴定-快速细胞破碎法(1)挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中,37℃振荡培养至A590值为0.6~0.8。(2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中,9000rpm离心9min,去尽上清。(3)加入70μlCracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml,加双蒸水至200ml],混匀后,37℃水浴30min以上。(4)15000rpm离心15min。(5)吸取上清点样电泳,观察。(四)转化子DNA的酶切鉴定1.转化子DNA的快速少量抽提(1)同本节 二.(三).1.(2)菌液移至5mlEppendorf 管中,9000rpm,离心9min,去上清。(3)加溶液Ⅰ100μl,溶液Ⅱ200μl,溶液Ⅲ150μl,混匀,冰浴10min。(4)15000rpm离心15min。(5)吸取上清,加入异丙醇1ml混匀,置室温15~30min。(6)15000rpm离心15min,弃上清,加入75%乙醇洗涤2次。(7)离心弃上清,真空抽干,加入适量1×TE溶解DNA。(8)取少量DNA电泳,观察浓度。2.转化子DNA的小量酶切鉴定同质粒DNA的小量酶切鉴定,见本节 一(三)。(五)重组子DNA的进一步鉴定可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定,详见本节 四。[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段(1)用合适的酶切割DNA并电泳。(2)于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带,装入含1×TBE缓冲液的透析代内,用夹子封好袋口,并检查有无漏孔。(3)将透析袋(纵长)与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳,4~5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。(4)取出透析袋,挤出凝胶块,吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内,10000rpm离心5min。(5)吸出上清放入离心管内,加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿,振荡混匀,10000rpm离心5min,吸出上清放入新的离心管内。(6)加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇,于-20℃放置4~5h。(7)于4℃,10000rpm离心15min,弃上清。(8)用75%的酒精洗涤2次,每次均于4℃,10000rpm离心5min,弃上清。(9)真空抽干,并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。三、地高辛配基随机标记DNA探针法(一)概述基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础,在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是:制备DNA探针,标记探针,检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来,非同位素标记方法发展很快,已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法,是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是:用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上(Dig-dUTP)。用随机引物及DNA多聚酶,以探针DNA为模板,合成互补DNA,化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合,加入显色底物,在碱性磷酸酶作用下,转变成深棕色或蓝色的化合物。1.标记 本试剂盒采用随机引物标记方法,可标记少至10ng,多至3μg的DNA。能在新合成的DNA链每20~25个核苷酸,掺入一个Dig-dUTP,反应时间约为1h。2.杂交 按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于-20℃,重复使用。3.免疫学检测 封阻后,检测反应的第一步,抗体结合物与标记DNA结合,出现杂交的半抗原-标记DNA,显色反应起始是在碱性pH条件下加入无色的显色剂X-磷酸盐和NBT,在几分钟内便开始出现蓝色,显色反应的过程持续3d。典型的例子是在24h后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后,尼龙膜可重新用于杂交。4.应用 地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒,能检测0.1pg的同源DNA,能检测1μg哺乳动物DAN中的单拷贝基因,与放射性标记系统比较,此试剂盒能快速得到实验结果(从DNA的标记和杂交至见到检测结果24h内能完成),而且消除了放射性的不安全问题。这试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术(包括DNA-印迹转移,菌落杂交,噬菌斑杂交及原位杂交)以替代同位素标记和放射自显影术。(二)试剂盒成份1.无标记对照DNA1 此管内有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分别用BamHⅠ,BglⅠtHinfⅠ消化,它们的混合比例为2:3:3,共有16个Pbr328片段,这些片段的大小分别为:4907,2176,1766,1230,1033,653,517,453,298,234,234,220和154×2bp。2.无标记对照DNA2 此管内有20μl pBR328 DNA200μg/ml,已用EcoRⅠ线性化。3.DNA稀释缓冲液 有两管,每管1ml[成分为:Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA(50μg/ml)。4.标记对照DNA 此管内有50μl线性化pBR328DNA,按标记方法已标记有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA,每毫升含5μg合成的标记DNA。5.六聚核苷酸混合物6.标记用混合底物 此管内有50μl10倍浓度的dNTP标记用混合底物,含dATP(1mmol/L)dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。7.DNA聚合酶Ⅰ大片段(标记级) 此管内有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow),2U/μl。8.(Dig)AP结合物 此管内有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段,结合有碱性磷酸酶750U/ml。9.NBT 有两管,每管1.25ml,是溶于70%(V/V)二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液(75mg/ml)。10.X-磷酸盐 有两管,每管0.9ml,是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液(50mg/ml)。11.封阻试剂 有两瓶,每瓶有50g粉剂。(三)需配制的溶液EDTA(0.2mol/L),pH8.0(20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇;Tris-HCl(10mmol/L);ED-TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐;10%(V/V)SDS;20×SSC:3mol/l NaCl;0.3mol/L柠檬酸三钠;pH7.0Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris–HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。(四)操作方法1.标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA,也可标记更大量的DNA,但所有的成分和体积要相应增加。(1)DNA探针热变性,煮沸10min,迅速冷却于冰/乙醇中5min以上,待用。(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上,加下列及试剂:新鲜变性的DNA 1-3μg六聚核苷酸混合物 2μl(管5)dNTP标记用混合底物  2μl(管6)加无菌重蒸水至  19μlDNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow) 1μl(管7)(3)在37℃保温至少60min,可到20h。(4)煮沸5min,终止反应。(5)15000rpm离心30s,置于冰上待用。2.预杂交 按100cm2膜用20~40ml预杂交溶液,预杂交时使溶液处于流动状态。预杂交液组成:5×SSC0.5%(W/V)封阻试剂(管11)0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠0.02%(W/V)SDS膜放入塑料袋,灌入预杂交液,排除气体后密封,在65℃预杂交过夜。3.杂交 按100cm2膜用2.5ml杂交液,杂交时偶尔摇动杂交袋,使里面的溶液重新分配。杂交液组成: 50%甲酰胺(V/V)5%(W/V)封阻试剂5×SSC0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠0.02%(W/V)SDS新变性标记DNA(150ng/ml)杂交液取代预杂交液,替换间膜不能干,成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜(16~20h)。4.洗膜按100cm2膜用250ml洗膜液计算。(1)在室温下用2×SSC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗,5min,2次。(2)在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗,10min,2次。(3)在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。5.免疫测定(1)配制溶液缓冲液1:Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)缓冲液2:0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50~70℃,此溶液保持混浊)。缓冲液3:Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。缓冲液4:Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)显色溶液:新鲜配制,在10ml缓冲液3中,加45μlNBT溶液(管9)和35μlX-磷酸盐缓冲液(管10)。2. 显色过程A.膜在缓冲液1中短暂洗涤(1min)。B.在100ml缓冲2中保温30min。C.再用缓冲液1短暂洗涤。D.用缓冲液1稀释的抗体结合物(管8)至150U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。G.膜在缓冲液3中平衡2min。H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时,不可振荡或搅拌。I.当要求的点或带已被检测时,可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。J.摄相。说明:上述各反应均在室温下进行,除了显色反应外,均需振荡或搅拌。(五)排除实验中问题的方法1.DNA不能有效地被标记时考虑(1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀,重新纯化DNA。(2)标记反应的保温时间延长(增至20h)。(3)DNA变性或许不完全,这时对大片段DNA特别重要。2.不能达到预期的灵敏度时考虑(1)DNA标记率。(2)增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。(3)显色反应的时间可延长至3d。3.若显色时背景过深,可采取(1)在杂交溶液中减少标记DNA量。(2)增加杂交溶液的体积,使膜随意漂浮在溶液中。(3)某些类型的尼龙膜可能产生深色背景,因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。(4)在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。四、核酸的分子杂交核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上,然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点介绍直接点样技术,转移技术及其它常用的杂交技术。(一)斑点杂交的直接点样法斑点杂交或叫打点杂交(dot-blot hybridization),其主要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品,操作简便,灵敏度高。一个点样品只含0.25~1pg的DNA也能检测到。但不知道杂交片段的大小(碱基对数)。1.DNA的打点法(DNa Dot Blot)(1)膜的处理:戴上干净手套,取出硝酸纤维膜,按需要剪成一定大小,量好各样点间距离,用软铅笔标记。(2)DNA变性:将DNA溶液于1×TE(pH8.0)缓冲液中或蒸馏水中,取一定量DNA样品加于小塑料管中,在100℃沸水中煮10min,迅速入冰水中。(3)点样:用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1~5μl变性DNA,将滴管放在硝酸纤维膜上,使DNA慢慢吸在滤膜上,点样完后凉干。(4)固定:将凉干的滤膜夹在滤纸中,于80℃干烤2~3h,然后进行杂交。2.RNA的打点法(RNa Dot Blot)(1)膜的处理:同DNA的打点法。(2)RNA变性:将提取的RNA与50μl 20×SSC/甲醛(30μl20×SSC加20μl甲醛)混合,65℃水浴15min。(3)点样:同DNA的打点法。(4)固定:同DNA的打点法。(二)DNA的吸印转移法(Southern Blot)DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后,放入碱性溶液中使其变性,将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上,然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置,而且能测定分子量。试剂:变性液:0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl中和液:1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaClpH8.020×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/l NaCl1.电泳 取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切,电泳鉴定酶切完全后,取酶消化后的DNA点样于0.8%~1.2%的凝胶上,以0.8~1V/cm电压电泳过夜,在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转,紫外灯照射10~20min后拍照。2.变性与中和 将电泳后的凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸馏水洗胶1min,将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。3.转移 取托盘一只,放入10×SSC溶液约500~1000ml,托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃,取一长方形Wateman paper(滤纸)搭在桥上,两边浸入10×SSC溶液中,仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡(用玻棒在滤纸上滚动)。将凝胶放在滤纸上,去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上(如NC膜浸湿不均匀,则考虑更换NC膜,操作时手切勿触及NC膜),去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸(长和宽均比NC膜小1mm)放在NC膜上,仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小,重叠放在滤纸上,再压一重物约500~1000g。转膜24h,中间更换吸水纸。图23-7 Southern转膜示意图4.固定用2×SSC溶液洗膜5min去掉残余凝胶,让膜自然凉干。将凝胶放入EB液中30min,取出在UV灯下观察是否有DNA残余。80℃烤膜2h,然后将膜封入塑料袋进行杂交。(三)RNA的吸印转移法(Northern blot)在RNA凝胶电泳之前,先用乙二醛等变性剂处理RNA,再在适宜条件下电泳使充分变性的RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂,然后进行杂交。试剂:乙二醛:4mol/L(约为30%),经过阴阳离子交换树脂纯化,使pH为5.5~6.0磷酸缓冲液:80mmol/L pH6.5~7.0磷酸缓冲液:10mmol/L pH6.5~7.0Tris-HCl:20mmol/L pH7.8二甲基亚砜:分析纯20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/l NaCl1.RNA变性 吸取1μl 80mmol/L磷酸缓冲液,1μl RNA样品(最多100μg),2μl,4mol/l 乙二醇,4μl二甲基亚砜。混匀后,50℃水浴1h,然后放入冰中。2.电泳 变性结束后,加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸缓冲液2μl和少量溴酚蓝,混匀后点样于1.0%的凝胶上,以4~5V/cm电压电泳。凝胶电泳液为10mmol/L磷酸缓冲液,pH6.5~7.0。3.转移 变性处理后的RNA可以转移并结合到硝酸纤维膜上,转移过程和转移变性与DNA相同。4.固定 用20×SSC转移RNA。膜夹在两层干净滤纸中凉干后,80℃烤膜2h5.乙二醛附加物消除 RNA膜固定后,放入20mmol/l Tris-HCl中,100℃处理5~10min,去除乙二醛,然后进行杂交。(四)硝酸纤维膜固相杂交核酸样品经过直接点样或转移到硝酸纤维膜上,固定后,可以进行杂交反应。在杂交溶液中,硝酸纤维膜上变性的核酸样品和变性后的探针在一定的条件下形成双链杂交核酸分子。然后进行酶标显色。试剂及操作方法见本节 三。五、真核细胞基因组DNA的制备从不同组织细胞或血细胞中提取DNA是进行基因诊断的先决条件。制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净,又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取DNA的反应体系中,SDS是离子型表面活性剂,主要作用是:(1)溶解膜蛋白而不破坏细胞膜;(2)解聚细胞中的核蛋白;(3)与蛋白质结合,使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸,使DNA分子尽量完整地分离出来。具体方法如下:(一)白细胞DNA的制备(1)采集外周静脉血10ml,加1.7ml ACD(柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2灭菌30min)抗凝。(2)将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内,加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/lTris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2、1%Triton –X 100],轻轻上下振荡至透明,红细胞完全溶解。(3)冰浴10min,离心,3000rpm,10min。弃上清,STMT重复处理1~3次。(4)弃上清,白色沉淀物加10mlSTE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)],先少量,充分混匀,然后加10mg/ml蛋白酶K100μl,20%SDS30μl,摇匀,置37℃水浴15~20h。(5)用等体积饱和酚抽提,3000rpm离心5min。(6)用大口钝缘吸管小心吸取上层水相,加饱和酚和氯仿-异戊醇(24:1)抽提,3000rpm离心5min 。(7)小心吸取上层水相,用等体积氯仿-异戊醇(24:1),抽提,3000rpm离心5min。(8)小心吸取上层水相,加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀,-20℃过夜。(9)将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出,放入Eppendorf管内,加1ml 75%乙醇4℃静置1h,离心,10000rpm10min。(10)弃上清,用蜡膜将管口封好,针刺数个小孔,真空抽提(10~15min)。(11)加200μl1×TE溶解,置4℃保存。(12)对所提DNA用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。(13)取2~4μl DNA样品,经琼脂糖凝胶(Agarose)电泳,检查所提DNA的质量及降解情况。(二)组织DNA的制备(1)将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎,加4ml 1×RSB缓冲液(10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/lNaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4)放入10ml带盖的塑料管中。(2)加SDS至浓度为1%(可加0.4ml10%SDS),混匀。由于DNA从核中释放出来,样品变得粘稠。(3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl,终浓度为100μl/ml,37℃保温1~3d,直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。(4)用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇(24:1)各抽提一次,3000rpm离心5min,用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。(5)加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段DNA,并移入一新管,吸干DNA中的无水乙醇。(6)DNA溶于4ml 0.1×SSC中,4℃过夜可作进一步纯化。(7)加20μlRNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml5mol/L NaCl。(8)同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提,乙醇沉淀离心,弃上清。(9)75%乙醇洗涤2次,离心,弃上清,真空抽干。适量1×TE溶解,保存在4℃。六、转移基因最常用的将克隆重组的DNA片段导入哺乳动物细胞的方法是用磷酸钙介导的转染。转染的DNA可能是通过吞饮作用进入细胞质,然后进行细胞核。(1)配制下列溶液①2×HEPES-缓冲盐溶液(HBS)②2mol/L CaCl2③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm滤器过滤除菌,分装贮存于4℃。④DNA:将DNA(约20μg/106细胞)溶于0.1×TE(pH8.0),使用浓度为40μg/ml。为使转化效率达到最高,质粒DNA应用CsCl-溴化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。如果所用DNA量较少,应加入载体DNA将DNA浓度调至40μg/ml。实验室制备的真核载体DNA转染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鲑鱼精DNA高。载体DNA用前应通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。(2)转染前24h用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期的细胞,以1~2×105细胞/cm2的密度重新种入60mm组织培养皿中。在37℃、5%~7%CO2及一定湿度的培养箱中培养20~24h。(3)每转染一个60mm培养皿中的单层细胞,须依如下方法制备磷酸钙-DNA共沉淀物:取步骤一所制备的DNA[40μg/ml,溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的灭菌5ml塑料管中,缓慢加入31μl 2mol/l 氯化钙(温和混合30s左右)。于室温育20~30min,其间将形成细小沉淀。温育结束时,用吸管将混合液吹打一次,使沉淀物悬浮。通常采用的另一方案是将氯化钙和DNA的稀释混合液加入2×HBS溶液中,逐滴加入并小心混合250μl按步骤一制备并溶于氯化钙(250mmol/L)的DNA。按照前述方法温育之。如果需要转染更为大量的细胞,上述两种反应混合液的体积均可翻一番或翻两番。如果体积翻两番,则须使用更大的塑料管,一般在25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上,可将0.5ml磷酸钙-DNA共沉淀物加入5ml培养液中,而在90mm细胞培养皿上,一般将1ml沉淀物加入10ml培养液中。已经发表的方案中,混合各组分的方式与速率大不相同。其中有一些认为除了温和振摇之外,其它措施均无济于事,并建议用电动移液装置吹出的空气来混合溶液。其它一些方案则规劝在加入DNA溶液时连续而缓慢地混匀,然后再温和振荡。其目的是为了避免急速形成粗沉淀物,以致降低转化效率。实际上,除了混合的速度之外,还有其它若干因素包括DNA的浓度和大小(让高分子量DNA从细针头中通过,可将之剪切变小)、缓冲液的精确pH(有些工作者配制了几批pH范围从6.95至7.1不等的HBS缓冲液,逐批试验沉淀物的质量及转染效率)。如果必须使转染效率达到最高,就要花时间针对特定的系统优化上述几种因素。一旦得到一批灵验的试剂,只需依照前面方法进行配制和贮存,即可在长期内获得可重复的结果。(4)将磷酸钙-DNA悬液转移至细胞单层上的培养液中[在60mm培养皿中,可将0.5ml悬液加入5ml培养液中],轻轻左右晃动一下培养皿使培养液得以混合,此时可见培养液成黄橙色浑浊状。另一方法是吸出培养液,直接把沉淀物加到细胞上,将细胞置于室温温育15min,然后再将培养液加回到培养皿中,此时细胞上有许多细小颗粒。采用以上两种方法,都要在37℃、5%~7%CO2及一定湿度的培养箱中将转染细胞培养长达24h[时间的长短取决于后续处理步骤的不同,见步骤(5)]。(5)然后,转染细胞可依以下任一种方法处理:①如果不进行其它处理(如用氯喹、甘油或丁酸钠等试剂处理,见后),可在细胞培养16~24h后,吸出培养液和沉淀物,用PBS将单层细胞再洗一次。然后按下述③d操作。②在许多情况下,同时用氯喹处理细胞,可提高DNA摄入率。氯喹可能是通过抑制溶酶体水解酶类对DNA的降解而起作用的。氯喹浓度及其处理时间不能超越细胞对其毒性作用的耐受能力。因此必须通过预实验来决定适于所用特定型别细胞的最佳氯喹浓度。但对于大部分型别的细胞,用终浓度为100μmol/L的氯喹处理3~5h,都可取得良好效果。可在磷酸钙-DNA共沉淀物加入细胞之前或之后(见步骤(4)介绍的其它方法),直接将氯喹二磷酸贮存液(过滤除菌并贮于-20℃用金属泊密封的管中,100mmol/L)稀释(1:100)于培养液中。在氯喹处理过程中,细胞呈现泡状是正常的。经用DNA和氯喹处理3~5h后,弃去培养液和沉淀,用PBS洗,然后按下述d操作。③用甘油短暂处理细胞,同样可提高转化效率或导入DNA的瞬时表达水平。这一步骤可以在氯喹处理之后进行。由于不同细胞对甘油的毒性作用的敏感性相差悬殊,因此每种型别的细胞都必须通过预实验决定最佳处理时间(从30s至3min)。耐受甘油的细胞可以暴露于含磷酸钙-DNA共沉淀物(含或不含氯喹)的生长液3~5h后进行休克。a. 吸出生长液,用PBS将单层细胞洗1次;b.在单层细胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油,在37℃培养0.5~3min;c.吸出甘油,用PBS将单层细胞洗1次;d.加入5ml预加温的完全生长液,放入培养箱中继续培养24~60h后,检测DNA的瞬时表达或将细胞重新种入适当的选择性培养基中,分离稳定的转化体。④业以表明,丁酸钠也可以在猴源和人源细胞中增强带SV40早期启动子/增强子的重组质粒的表达。可直接在生长液中加入有关试剂,也可以使经过甘油休克的细胞接受丁酸钠处理。须视细胞型别的不同,采用不同浓度的丁酸钠(500mmol/L贮存液,在化学通风橱中用NaOH中和丁酸制备而成),例如:CV-110mmol/LNIH-3T3 7mmol/LHelaS3 5mmol/LCHO 2mmol/L不加完全生长液,然后重复步骤d。(6)转移基因表达和细胞集落形成①瞬时表达:在转染后48~60h收获细胞,进行RNA或DNA杂交分析。新合成的蛋白质可以用放射免疫测定Western印迹,体内代谢标记-免疫沉淀或者细胞提取液中酶活性的测定等方法来进行分析,如果测定中有重复品或者转染细胞要经过多种不同条件或在一段时间历程以内取不同时间进行处理,就要避免皿与培养皿之间转染效率的偏差。在这些情况下,最好转染大片的单层细胞(90mm培养皿),培养24h后用胰蛋白酶进行消化,再分接到若干较小的培养皿上。②稳定转化:在非选择性培养基中培养18~24h,使所转移基因得到表达之后,用胰蛋白酶消化细胞,种入适当的选择性培养基中。这种培养基在2~3周内每2~4d须更换1次,以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。可以克隆单个细胞集落,增殖后进行测定。可以用冰预冷的甲醇将仍保留在培养皿内的细胞固定15min,再于室温用10%Giemsa染色15min,最后用自来水冲洗,这样即可得到细胞集落数的永久记录。Giemsa染液可用PBS或水现用现配,并用Whatman 1号滤纸过滤。重新接种细胞以便取得分隔良好的细胞集落所要求稀释倍数,主要由稳定转化的效率来决定。这一效率可以相差若干个数量级,它起决于:a.受体细胞的型别(即使同一细胞系,克隆不同或传代数不同,也表现出显著差异);b.导入基因的特性及其转录调控信号强弱;c.转染中所用供体DNA的量。

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