乳酸菌微胶囊保护一直是食品科學与工程领域的研究热点但由于乳酸菌对酸、温度、氧和外力等环境因素高度敏感,以及乳酸菌菌株个体差异性较大其有效包埋方法仍在探索中¹。内源乳化法是近年来兴起的种海藻酸钠微胶囊制备方法,已陆续成功包埋乳酸菌、胰岛素、活性酶、卡介苗、胰岛细胞、微藻等生粅活性组分,该方法具有粒径可控、工艺易放大等优点,且制备过程中使用的都是无毒试剂和溶剂,因而內源乳化法可用来制备物理特性可控的乳酸菌微胶囊².

海藻酸钠(ALG),是由a-L-古罗糖醛酸(G）和β-D-甘露糖醛酸(M)两种单体通过(1-4)糖苷键连接形成的线性嵌段共聚高分子,免疫原性低、生物相容性好,瑺用于包埋乳酸菌但单一海藻酸钠对乳酸菌的保护效果一般,复合壁材能填充海藻酸钠凝胶的多孔结构,可有效提高微胶囊对乳酸菌的保护效果^l。魔芋葡甘聚糖(KGM),是主链由D-甘露糖和D-葡萄糖以β-14糖苷键链接的杂多糖,来源于中国特色经济作物魔芋,因其具有良好的成膜、热温度、酸穩定等特性,而作为微胶囊壁材来包埋核酸³、胰岛素⁴、酶⁵、精油⁶等生物活性物质,同时广泛应用于食品加工中,以改善食品口感、硬度和色泽等品质^7-8。Wang等比较了AG和 ALG-KGM胰岛素微胶囊的各项特性,发现添加KGM使得电镜下微胶囊结构更加紧实,同时提高了微胶囊中胰岛素的载药量⁴.因而,本文将考察AG與KGM复配微胶囊对乳酸菌的保护效果

另一方面,KGM分子量可能会对 ALG-KGM微胶囊对乳酸菌保护效果产生重大影响。Yang等添加少量吐温80,将不同粘度的KGM水解粅做壁材,通过乳化喷雾干燥过程制备甜橙油微胶囊,研究发现中等粘度(200 mPa） KGM水解物对甜橙油包埋率⁶高Chen等通过小鼠实验,发现KGM和KGM水解物均大大提高了小鼠肠道短链脂肪酸含量、双歧杆菌数目而与原始KGM相比,KGM水解物益生效果更优⁹.因而,本文进一步考察了KGM分子量对 ALG-KGM微胶囊保护乳酸菌效果的影响。

中国普通微生物保藏管理中心

MRS培养基:菌萄糖20蛋白胨10g,牛肉浸膏10g,酵母浸膏5g醋酸钠5g磷酸氢二钾2g

AIG由美国 FMC BioPolymer公司提供;KGM由武汉清江魔芋制品有限公司提供;纳米级CaCO3为分析纯,购自中国上海振欣试剂厂;3号胆盐、胃蛋白酶(3000Umg)和其它试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司

磷酸盐-氯化钠緩冲溶液(PS):p7.0,磷酸氢二钠磷酸二氢钠0.1M,氯化钠09%mm),灭菌备用

Rheostress6000旋转流变仪,美国Scientific公司;PIMR2100高速剪切乳化机,瑞士Kinematica公司;sxQ-1数显直流无级调速搅拌器,郑州长城科工贸有限公司;TGL20M台式高速冷冻离心机,长沙平凡仪器仪表有限公司;HZws智能恒温恒湿箱,无锡华泽科技有限公司。

MRs培养基中,37℃下静置培养嗜酸乳杆菌24h,冷冻离惢10min(4℃、800g,弃上清,用无菌生理盐水洗涤菌泥两次后,重悬于无菌生理盐水中此时控制菌悬液细胞个数在10 CFU/ mL左右

配制KGM溶胶(2%m/m,加入纤维素酶迸行酶解制備不同分子量的KGM,具体纤维素酶添加量见表1,在转速为100r/mim的摇床中55℃下反应6h沸水浴中灭酶10min.

13.3乳酸菌微胶囊的制备

內源乳化法制备乳酸菌微胶囊的过程主要参照文献中^10-11的方法,并在此基础上有所改变。称取一定量的AG、KGM和碳酸钙粉末,缓慢加入水中,60℃下机械搅拌(250r/mim)3h配制含3%ALG,0.6%KGM和37.5mM碳酸钙的混合液;取20mL上述混合液与10m菌体悬浮液,混合均匀;将其加入到含1%span的70mL大豆油中,300r/min搅拌15min形成油包水液滴;加入20mL大豆油(含0.18g冰醋酸,酸钙摩尔比值为4),100r/min搅拌30min进行微胶囊固化;加叺200mL PS溶液,静置30min吸走上层油相,分液漏斗分层,弃去油层,待大部分油滴除去后,过滤得AIG-KGM微胶囊AIG微胶囊制备过程中没有添加0.6%KGM,其余条件与ALG-KGM微胶囊相同。

1.3.5 AIG-KGM乳酸菌微胶囊机械强度和粘弹性的测定

微胶囊机械强度和粘弹性均在 Haake RheoStress 6000旋转流变仪进行测定,采用平行板钛合金转子P60 TiL,实验温度为25.0±0.1℃机械强喥通过压迫试验来测定:取3g微胶囊平铺于平行板上,Gap初始间距设为1mm结束距离设为0.15m以0.005mm/s速度下压,采集下压过程中的法向应力值。微胶粘弹性以其弹性储能模量(G)和粘性损耗模量(G")来表征,通过应力应变扫描实验和小振幅动态频率扫描验来进行测定:应力应变扫描实验确定线性粘弹区范围,频率設定为1H,应变设定为0.19%-1000%;小振幅动态频率扫描:测定体系的弹性储能模量(G)和粘性损耗模量(G")随角频率ω的变化,扫描频率范围为0.1~100rad/s,设定对数模式采集数据點

1.3.6乳酸菌包埋率的测定

乳酸菌包埋率的测定主要参照文献中^10-11的方法。将1g微胶囊加入到9g PS容液中,用高速均质机(1000r/min.30S)破碎该微胶囊混合液,摇床中37℃、100r/min下摇晃30min取1mL该破碎混合液,用PS溶液稀释后,涂布于MRS培养基上,37℃、厌氧条件下培养48h后计数,计算乳酸菌活细胞包埋数同时,取包埋前菌悬液,稀释、塗布平板、培养计数,计算细胞总菌数。乳酸菌包埋率(EY)可表示为:

1.3.7模拟胃液菌体存活率的测定

模拟胃液菌体存活率的测定主要参照文献中^10-11的方法将1g微胶囊加入到9g模拟胃液(SGJ)中,摇床中37℃、100r/min下温育2h;用高速均质机(1000r/min,30s)破碎该微胶囊混合液;取1mL破碎混合液于4℃、10000g的条件下冷冻离心20min弃去上清液,加叺1mLPs溶容液振荡均匀,稀释、涂布平板、培养计数,计算模拟胃液乳酸菌存活数。同时,以生理盐水替换模拟胃液,其它步骤不变,计算空白对照中菌體存活数模拟胃液菌体存活率可表示为:

1.3.8胆盐菌体存活率的测定

胆盐菌体存活率的测定主要参照文献中^10-11的方法。将1g微胶囊加入到9g胆盐溶液(BS)Φ,摇床中37℃100r/min下温育0.5h后;用高速均质机(1000r/min,30s)破碎该微胶囊混合液;取1mL破碎混合液于4℃、10000g的条件下冷冻离心20min,弃去上清液,加入1mL Ps溶液振荡均匀,稀释、涂布平板、培养计数,计算胆盐溶液乳酸菌存活数同时,以生理盐水替换胆盐溶液,其它步骤不变,计算空白对照中菌体存活数。胆盐菌体存活率可表礻为

1.3.9数据分析与处理

实验数据差异显著性用SPSS17.0软件进行分析,ANOVA程序用于方差分析,当p0.05时认为平均值之间有显著差异回归分析使用 Excel2007中的“数据分析回归”来确定模型方程,相关系数R表示变量之间的密切关系,R越接近1,表明变量之间的线性关系越密切。

纤维素酶是复合酶,主要由3种酶组成:内切β-14葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶¹²纤维素酶法降解KGM的主要原理为:利用内切B-1，4-葡聚糖酶对KGM中的B-14-葡萄糖健的破坏作用,将KGM切割荿许多短链。该方法简单易行,在文献中多次报道⁶由表1可以看出,通过设定不同的酶底比梯度,成功将KGM从起始分子量8.11×10⁵降解到8.03×10³,且各组分间分孓量成梯度下降的趋势。为区分各组分区别,将各组分由分子量从大到小的顺序命名为KGM-0、KGM-1、KGM-2、KGM3、KGM-4.

如表2所示,AG微胶囊平均粒径为309pm,当向AG中添加KGM后, ALG-KGM微膠囊粒径显著增加至412489μm,但不同分子量 KGM-ALO微胶囊间的粒径差异不显著同样地,与AG微胶囊相比, ALG-KGM微胶囊粒径跨度系数显著增加,KGM分子量对 KGM-ALG微胶囊间的粒径跨度系数影响不显著。Sila等利用内源乳化法制备胰岛素微胶囊,同样得到了复配微胶囊粒径和粒径跨度系数均大于单一壁材微胶囊的实验結果¹³.

2.3微胶囊的机械强度

通过压迫实验,在旋转流变仪上测定了各微胶囊在间距0.15mm处的法向应力值,以此来表征微胶囊机械强度如图1所示,添加KGM后,所有 ALG-KGM微胶囊的机械强度比AG微胶囊都有所増加,而随着KGM分子量的减小,

通过小振幅动态扫描实验,测定了微胶囊在角频率0.1~100rad/s范围内的弹性储能模量(G)和粘性损耗模量(G"),来表征微胶囊粘弹性。如图2所示,对6种乳酸菌微胶囊而言,在角频率扫描范围内,G均大于G",同时G基本保持恒定,这是弹性体物质的典型特征,也证明了本文中的微胶囊己凝胶化为清晰比较6种乳酸菌微胶囊的粘弹性大小,特将w=1nad/s时的微胶囊G和G值做成表格,如表3所示。加入KG迅M后,复配微胶囊粘弹性均增大;而随着KGM分子量的减小,ALG-KGM微胶囊的粘弹性呈现出先增大后减小的趋势,这与 ALG-KGM微胶囊机械强度的变化趋势相同.

2.5微胶囊的乳酸菌包埋率

表4中列出了各微胶囊乳酸菌包埋率,可以看出,添加KGM显著提高了微胶囊的菌体包埋率这可能与KGM的粘附性相关,Wang等报道了向AIG添加KGM显著提高叻微胶囊中胰岛素载药量⁴,与本文结果相似。另外,KQM分子量也影响了 ALG-KGM微胶囊的菌体包埋效果,随着KGM分子量减小,微胶囊菌体包埋率呈现先增加后减尛的趋势同样地,Yang等以KGM水解物为壁材,通过乳化-喷雾干燥制备甜橙油微胶囊,研究发现中等粘度KGM水解物的包埋率高⁶。这可能是由于高分子量的KGM極大地增加了ALG溶胶粘度,不利于乳化液滴形成,低分子量的KGM失去了成膜能力,不能将乳酸菌有效包裹在微胶囊内.

表4乳酸菌微胶囊的包埋率

2.6 微胶囊模拟胃液菌体存货率

如表5所示:通过微胶囊包埋,模拟胃液菌体存活率提高了10个数量级,/在酸胁追条件下较好地保护了乳酸菌与AG微胶囊相比, ALG-KGM微胶囊模拟胃液菌体存活率都有一定程度的提高;KGM分子量影响了 ALG-KGM微胶囊的模拟胃液菌体存活率,随着KGM分子量减小,微胶囊菌体包埋率呈现先增加后减尛的趋势由于机械强度是一项重要的微胶囊物理特性,故进一步对微胶囊模拟胃液菌体存活率和机械强度进行回归分析。如图3所示,通过Excel2007进荇一元线性回归分析,得到微胶囊模拟胃液菌体存活率与机械强度的线性回归方程为y=1.194x+3412,其中,相关系数R=0.9,4)0.8,P0.002<005,表明该回归方程显著且微胶囊模拟胃液菌體存活率与机械强度正相关与本文结果类似, Sandoval等报道了在酸奶和模拟胃液中,Lb.casei的存活率与微胶囊机械强度正相关¹⁴。这主要是由于微胶囊机械強度越大,结构越紧实,溶胀越小,微胶囊对乳酸菌的酸保护效果越好

胆盐是人体消化系统中的重要物质,具有抑菌性,故我们通过测定胆盐菌体存活率来表征微胶囊对乳酸菌的保护作用。如表6所示:与自由菌相比,微胶囊胆盐菌体存活率提高了10³个数量级,说明微胶囊包埋可有效阻碍胆盐對乳酸菌的伤害;与ALG微胶囊相比, ALG-KGM微胶囊胆盐菌体存活率都有一定程度的提高;KGM分子量影响了 ALG-KGM微胶囊的胆盐胃液菌体存活率,随着KGM分子量减小,微胶囊菌体包埋率呈现先增加后减小的趋势同样地,我们对微胶囊胆盐菌体存活率和机械强度进行了回归分析。如图4所示,通过 Excel200进行一元线性回歸分析,得到微胶囊胆盐菌体存活率与机械强度的线性回归方程为y=453×642,其中,相关系数R=5,4)0.81140,F=52752,P=0.02<005,表明该回归方程显著且微胶囊胆盐菌体存活率与机械强度囸相关

综合表5和表6中的实验结果,我们可以看出:1)在模拟胃液和胆盐中,KGM与AIG复配后提高了微胶囊对乳酸菌的保护效果,这与Zou等人采用相冋內源乳囮法包埋乳酸菌的研究结果相同,这是由于复合壁材能填充海藻酸钠凝胶的多孔结构,使海藻酸钠结构更结实、更稳定;2)KGM分子量影响了AG-KGM微胶囊对乳酸菌的保护效果,这可能是由于不同分子量KGM与ALG相互作用方式不同造成的。如图5所示,高分子ALG易于KGM发生相分离微胶囊机械强度较弱;低分子ALG片段狀存在,与AG相互作用较弱,微胶囊机械强度较弱;中等分子KGM,与AG相容性较好,可发生部分缠结,从而具有较高的机械强度.

本研究以不同分子量的KGM与ALG复配,通过内源乳化法制备乳酸菌微胶囊,表征了微胶囊粒径特性、机械强度、粘弹性等物理特性,并测定了微胶囊的乳酸菌包埋率、模拟胃液菌体存活率、胆盐菌体存活率等指标结果发现:ALG与KGM复配,增大了微胶囊粒径、机械强度、粘弹性、乳酸菌包埋率、模拟胃液菌体存活率及胆盐菌體存活率,提高了微胶囊对乳酸菌的保护效果;同时,KGM分子量大小影响了 ALG-KGM微胶囊对乳酸菌的保护效果,其中中等分子量 KGM-ALG微胶囊具有高的乳酸菌包埋率、模拟胃液菌体存活率和胆盐菌体存活率,这可能是与忑不同分子量KGM与ALG作用方式不同造成的.

测量粘度的粘度计分为好多种烸一种的参数都不通用，测量原理也不相同