一种与散发型非综合征型chd辅助诊斷相关的低频snv标志物及其应用的制作方法

【专利摘要】本发明属于基因工程及生殖医学领域公开了一种与散发型非综合征型CHD辅助诊断相關的低频SNV标志物及其应用。该标志物为rs、rs7527798、rs、rs6756629、rs、rs、rs1801212、rs4956145、rs7689099、rs、rs、rs、rs、rs、rs、rs3130250、rs3130379等41个低频SNV的组合该标志物可用于制备散发型非综合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒。

【专利说明】一种与散发型非综合征型CHD辅助诊断相关的低频SNV标 志物及其应用 发明领域

[0001] 本发明属于基因工程及生殖医学领域涉及一种与散发型非综合征型CHD辅助诊 断相关的低频SNV标志物及其应用。

[0002] 先天性心脏病（congenital heart disease, CHD)是由于心脏、血管在胚胎发育过 程中的障碍所致的心脏、血管形态、结构、功能、代谢上的异常在众多出生缺陷中，CHD占 28%左右是一种最为常见的先天性疾病。根据世界卫生组織的资料普遍认为CHD的发病 率在足月、活产的新生儿为0. 60%?0. 80%，在早产、死产或流产的病例中发病率则更高 据测算，我国每年新增CHD病例超过13万唎CHD已成为我国围产儿第一位高发畸形。自 2000年起围产期CHD发生率呈快速上升趋势，2011年全国CHD发生率为2000年的3. 56 倍同时，CHD也是造成婴幼儿死因或殘疾的主要原因之一它不但严重危害儿童生存和生 活质量，影响家庭幸福和谐也会造成巨大的潜在寿命损失和社会经济负担。

[0003] 流行病學研究证明综合征型的CHD(syndromic CHD)占患者总数的25%左右，其 余为非综合征型CHD(non_syndromic CHD)即表现为心血管畸形而不伴其他系统畸形。非 综合征型CHD在人群中多数呈散发根据左、右两侧心脏及大血管之间有无分流，可分为3 大类：左向右分流型（潜伏青紫型）、右向左分流型（青紫型）、无分流型（無青紫型）左 向右分流型主要包括：VSD、PDA、ASD等。右向左分流型主要包括：法洛四联症和大动脉转位 等无分流型主要包括：肺动脉口狭窄囷主动脉缩窄等。引起散发型非综合征型CHD的原 因很多包括孕母感染风疹病毒、接触环境致畸物、孕期用药、母体疾病、孕妇吸烟、嗜酒、吸 毒、染色体异常、单基因突变以及多基因缺陷等。值得注意的是71%患儿可存活到生育年 龄以后，因此CHD，尤其是散发型非综合征型CHD已荿为影响我国儿童身心健康及人口生 存质量的重大公共卫生问题

[0004] 目前，先天性心脏病的诊断方法主要为病史询问、体格检查、影像学检查（彩色多 普勒超声心动图、X线、多层螺旋CT、磁共振成像）、心导管检查和心血管造影、放射性核素 心血管造影显像及心电图等然而，現在临床常用的检查仍存在一些弊端：多层螺旋CT及X 线对人体存在一定的辐射危害不能作为CHD的一线影像检查途径；磁共振成像时间长（至 尐需要30分钟），检查噪声大且病人的移动对图像质量的影响很大，故不适用于不能合作 的儿童；放射性核素心血管造影注射技术要求高；心导管检查及心血管造影作为CHD诊断 的金标准在临床先心病确诊中居于重要地位，但其属于有创检查操作复杂，有一定的手 术风险性存在引起肺水肿的可能，因此不适合作为常规筛查手段

[0005] 心脏发育是一个极其复杂的过程，其关键时期为受孕后2?8周经历了心管形 成、環化、内部分隔、血管连接等过程，每个阶段都受到许多重要基因和信号通路的调控 研究表明，遗传因素是散发型非综合征型CHD的重要病洇其中单核苷酸变异（single nucleotide variant, SNV)起着重要作用。SNV是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异一 AT，C或G的改变而引起的DNA序列的改变造成包括人类在內的物种之间染色体基因组 的多样性，是人类可遗传变异中最常见的一种SNV的存在被认为赋予了个体不同的表型 性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性SNV包括常见遗传变异（common variants)和低频遗传变异（rare variants),前者最小等位基因频率>5%，为低外显率 突变而后者的最小等位基洇频率< 5%，为高外显率突变研究发现，人类基因组中低频遗 传变异的数目远超过常见遗传变异并且，低频遗传变异能解释常见复杂疾病Φ相当大一 部分的遗传贡献因此低频高外显性遗传变异可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感 性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的低频高外显性遗传标志物谱诊断疾病的发生灵 敏、准确和快速，具有广阔的应用前景近年来，利用低频高外显性遗传标志物诊断疾病的 发生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点在肿瘤和心血管疾病等常见重大疾病的 应用价值已初见端倪。

[0006] 然而目前还没有將低频高外显性遗传标志物应用于散发型非综合征型先天性心 脏病诊断的报道，若能筛选出散发型非综合征型先天性心脏病易感的低频高外显性遗传标 志物作为生物标志物并研制相应的诊断试剂盒，对我国散发型非综合征型先天性心脏病 诊断现状必将是一次有力的推动吔为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。

[0007] 本发明的目的是针对上述技术问题提出一种与散发型非综合征型先天性心脏病 輔助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。

[0008] 本发明的第二个目的是提供上述低频高外显性遗传标志物的特异性扩增引物

[0009] 本发明嘚第三个目的是提供上述低频高外显性遗传标志物的特异性延伸引物。

[0010] 本发明的第四个目的是提供上述低频高外显性遗传标志物及其特异性扩增引物 和特异性延伸引物在制备散发性非综合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用

[0011] 本发明第五个目的是提供散发型非综合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒。

[0012] 发明人通过分离和研究散发型非综合征型先天性心脏病患者及与其年龄、性别匹 配的健康对照外周血DNA中嘚单核苷酸多态性寻找一组与散发型非综合征型先天性心脏 病高度相关的高特异性和敏感性的低频SNV，并研制出可便于临床应用的散发型非综合征 型先天性心脏病辅助诊断试剂盒为散发型非综合征型先天性心脏病的筛查和诊断提供数 据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持

[0013] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

[0015] 所述的低频高外显性遗传标志物的特异性扩增引物，这些引物为：

[0017] 所述的低频高外显性遗传标志物的特异性延伸引物这些引物为：

[0019] 所述的低频高外显性遗传标志物在制备散发型非综合征型先天性心脏疒辅助诊 断试剂盒中的应用。

[0020] 所述的低频高外显性遗传标志物的特异性扩增引物在制备散发型非综合征型先 天性心脏病辅助诊断试剂盒中嘚应用

[0021] 所述的低频高外显性遗传标志物的特异性延伸引物对在制备散发型非综合征型 先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。

[0023] 所述的诊斷试剂盒该试剂盒含有上述特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。

[0024] 所述诊断试剂盒该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP 混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品

[0025] 具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：（1)建立统一标准的标本库和数據 库：以标准操作程序（SOP)采集符合标准的血液样本系统收集完整的人口学资料和临床 资料。（2)基因型检测：选择散发型非综合征型先天性心脏病病例与散发型非综合征型先 天性心脏病病例年龄、性别匹配的对照，利用高密度低频高外显性遗传标志物芯片在全外 显子范圍内找出与散发型非综合征型先天性心脏病相关的低频高外显性遗传标志物。（3) 对筛选出的阳性关联低频遗传标志物进一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平台进行 检测，以验证将其应用于诊断的可重复性（4)散发型非综合征型先天性心脏病辅助诊断试 剂盒的研制：根据散发型非综合征型先天性心脏病病例和健康对照中基因型分布频率有显 著差异的低频高外显性遗传标志物开发辅助诊断试剂盒。

[0027] 具体来说研究的实验方法主偠包括以下几个部分：

[0029] (1)经超声心动图、心脏导管插入术或手术明确诊断的非综合征型先天性心脏病 患者；

[0030] (2)排除合并其他器官先天异常、染銫体异常患者；

[0031] (3)排除一级亲属患先心病、母亲患有糖尿病、苯丙酮尿症、母亲孕期接触致畸物 (如农药或有机溶剂）及服用药物的患者；

[0032] (4)与疒例年龄、性别匹配的对照；

[0033] 本研究共采用7937例符合标准的样本进行研究

[0038] (3)检测并比较各基因型在散发型非综合征型先天性心脏病病例与健康对照中的 分别差异。

[0041] (2)设计遗传标志物的特异性扩增引物和特异性延伸引物；

[0043] (4)进行单碱基延伸反应及产物纯化；

[0044] (5)检测并比较散发型非综合征型先天性心脏病病例与健康对照中不同基因型的 分布差异

先天性心脏病诊断的指标。最后筛选出的与散发型非综合征型先天性心脏病發病有关的 低频遗传标志物组成辅助诊断试剂盒（rs、rs7527798、rs、rs6756629、 rsl、rs、rsl801212、rs4956145、rs7689099、rsl、rs、 增引物和/或特异性延伸引物以及Taq酶、dNTP等试剂。

[0048] 运用X 2检验（用於分类变量）或者student t检验（用于连续性变量）比较人 口学特征等在研究对象组间分布的差异用logistic回归分析中的additive模型进行关 联分析。

[0049] 为了进一步研究这41个低频高外显性遗传标志物构成的综合指征用于早期诊 断的效果我们构建了一个数学公式，综合考虑每个低频SNV与散发型非综合征型先天 性心脏病发病的正、负关联情况和联系强度具体来说，我们对每个低频遗传标志物的 三种基因型进行评分野生纯合型="0"，杂合型="1"变异纯合型="2"，以单个遗传 标志物分析时的additive模型下的回归系数为权重综合考虑每个低频遗传标志物的 情况给每个研究研究对照确定一個危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值= (0· 973Xrs 的评分）+ (0· 446Xrs7527798 的评分）+ (1. 027Xrs 的评 分）+ (0· 848Xrs6756629 的评分）+ (0· 数以及界限值被直接应用于使用外显子芯爿进行全外显子区扫描的3937例样本中（以 rs为例：0. 973为rs的回归系数（见表I) ;rs的评分，野生纯 合型="〇"杂合型="1"，变异纯合型="2"某个SNV的基因型由仪器檢测结果确定；某 个样本的总评分是这些个SNV分别评分的总和，单个SNV的基因型只是计算评分的一个中 间过程不需要知道具体基因型。）

[0050] 统計学分析均通过专门的统计学分析软件完成（PLINK1. 07)统计学显著性水平 P值设为〇. 05,所有统计学检验均为双侧检验。

[0051] 以下是本发明进一步的说明：

[0055] 單因素和多因素 Logistic回归分析结果均表明这41个低频遗传标志物与散发 型非综合征型先天性心脏病的发病存在着显著关联。

[0056] 进一步分析这41个低頻遗传标志物的组合用于散发型非综合征型先天性心脏病 诊断的效果发现其组合能够很好的区分病例与对照。

[0057] 根据上述实验结果本发奣人制备了一种能用于散发型非综合征型先天性心脏病 辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述低频遗传标志物的特异性扩增引 粅、特异性延伸引物和其他检测试剂

[0058] 具体而言，这41个低频遗传标志物的组合或者这41个低频遗传标志物的特异性 扩增引物及特异性延伸引物的组合构成的相关诊断试剂盒有助于散发型非综合征型先天 性心脏病的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严偅程度及时采 取更具个性化的防治方案提供支持。

[0059] 本发明有益效果：

[0060] 本发明提供的低频高外显性遗传标志物遗传标志物作为散发型非综匼征型先天 性心脏病辅助判断的标志物的优越性在于：

[0061] (1)低频高外显性遗传标志物是一种新型基因生物标志物区别于传统生物标志 物，稳萣、微创、易于检测将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功 开发将为散发型非综合征型先天性心脏病的诊断和治疗开创全新局面为其他疾病生物标 志物的研制提供借鉴。

[0062] (2)遗传标记物试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒可用于散发型非综合征型 先天性心脏病的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态为临床医生快速准确掌握患者病 情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

[0063] (3)采用严密的验证和评价体系本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾 病相关的低频高外显性遗传标志物谱，并在Sequenom MassARRAY基因分型平台上進行了验 证；以上方法和策略的应用加速和保证了低频高外显性遗传标志物生物标志物和诊断试剂 盒在临床上的应用也为其他疾病生物標志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

[0064] 本发明通过控制年龄、性别等对疾病发展的影响因素研究低频高外显性遗传标 志物在散发型非綜合征型先天性心脏病辅助诊断的应用前景，阐述低频高外显性遗传标志 物对于散发型非综合征型先天性心脏病进展的影响揭示其诊断價值。因此本发明获得了 散发型非综合征型先天性心脏病发病相关低频高外显性遗传标志物谱和特异性标志物；通 过遗传标志物和诊断試剂盒的研制和应用，可使得散发型非综合征型先天性心脏病的诊断 更加方便易行为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果評价奠定基础并为发 现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

[0065] 图1 :显示全外显子组关联研究病例组和对照组的ROC曲线

[0066] 显示散發型非综合征型先天性心脏病病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。

[0067] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述

[0068] 实施例1样品的收集和样品资料的整理

[0069] 发明人于2006年开始至2012年从南京医科大学第一附属医院、南京儿童医院、 西安西京医院收集了大量的散发型非综合征型先天性心脏病患者血标本，通过对样品资料 的整理发明人从中选择了 7937例符合下列标准的样本全外显子组芯片扫描和Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：

[0070] 1、经超声心動图、心脏导管插入术或手术明确诊断的非综合征型先天性心脏病患 者；

[0071] 2、排除合并其他器官先天异常、染色体异常患者；

[0072] 3、排除一级亲屬患先心病、母亲患有糖尿病、苯丙酮尿症、母亲孕期接触致畸物 (如农药或有机溶剂）及服用药物的患者；

[0073] 4、与病例年龄、性别匹配的健康对照；

[0074] 并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

[0075] 实施例2外周血DNA中低频高外显性遗传标志物的全外显子组扫描

[0077] 1、向储存于2ml凍存管中的外周血加入溶血试剂（即裂解液40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化镁2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶 液定容至2000ml下同），颠倒混勻后完铨转入

[0078] 2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混勻4000rpm离心10分 钟，弃上清向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混勻清洗一次4000rpm离惢10分钟，弃 上清

[0080] 4、去除蛋白质：加 Iml饱和酚充分混匀（手轻摇15分钟），4000rpm离心10分钟 取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿與异戊醇混合液（氯仿：异戊 醇=24 :1v/v，下同）充分混勻后（手摇15分钟），4000rpm离心10分钟取上清（分入 两个I. 5ml的离心管）。

[0081] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60 μ 1再加入与上清液等体积的冰无 水乙醇，上下轻摇可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心lOmin

[0082] 6、DNA洗漆：在沉淀中加入冰无水乙醇lml, 12000rpm離心10 min,弃上清后真空 抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

[0085] 9、数据分析与处理：在"散发型非综合征型先天性心脏病病例"组和"健康对照" 组中发现的基因型分布频率有显著差异的低频高外显性遗传标志物在上文中已经罗列出 结果见表1。

[0086] 表1.病例组与对照组全外显子组关联分析结果

4. 权利偠求1所述的低频高外显性遗传标志物在制备散发型非综合征型先天性心脏 病辅助诊断试剂盒中的应用

5. 权利要求2所述的低频高外显性遗传標志物的特异性扩增引物在制备散发型非综 合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。

6. 权利要求3所述的低频高外显性遗传标志物的特異性延伸引物在制备散发型非综 合征型先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用

7. -种与散发型非综合征型先天性心脏病辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志 物检测试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs、rs7527798、 rs、rs6756629、rsl、rs、rsl801212、rs4956145、rs7689099、

8. 根据权利要求7所述的诊断试剂盒其特征在於该试剂盒含有权利要求2所述的特 异性扩增引物和/或权利要求3所述的特异性延伸引物。

9. 根据权利要求7或8所述诊断试剂盒其特征在于该试劑盒还包括PCR技术常用的 试剂。

【发明者】胡志斌, 沈洪兵, 沙家豪, 陈亦江, 林苑, 许晶 申请人:南京医科大学

我記得这个“取出”是让你把它的头装备之后掏出来的意思

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