：细胞的活化及扩增的制作方法

發明领域本发明一般涉及刺激并活化细胞的方法更具体而言，涉及活化并扩增细胞到很高密度以及扩增细胞到很高数量的方法本发明吔涉及细胞组合物，包括高浓度以及扩增到高数量的经活化及扩增的T细胞

相关技术描述T细胞抗原受体(TCR)是一种多亚基免疫识别受体，和CD3复匼物结合并与抗原提呈细胞(APCs)表面的主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类蛋白质提呈的肽相结合。TCR与APC上抗原性肽的结合在T细胞和APC触点的免疫突觸处发生，是T细胞活化中的重要事件

为维持T细胞活化，T淋巴细胞一般需要第二共刺激信号共刺激一般为TT辅助细胞细胞所必需，以产生足以诱导克隆扩增的细胞因子水平Bretscher，Immunol.Today 13741992；June等人，Immunol.Today153211994。活化的抗原提呈细胞(APC)上B7家族配基(CD80(B7.1)或CD86(B7.2))的成员与T细胞上CD28结合时发生主要共刺激信号。

刺激某些T细胞亚群扩增的方法有可能产生多种用于免疫治疗的T细胞组合物。通过有效刺激增加T细胞的反应性和数量，有助于成功的免疫治疗

现有的扩增人T细胞的各种技术主要有赖于使用T辅助细胞细胞和/或外源生长因子，例如白细胞介素-2(IL-2)IL-2已经与抗CD3抗体结合用于刺激T细胞增殖，主要扩增T细胞的CD8+亚群据认为，理想的T细胞活化、扩增以及T细胞再输注后的长期存活需要这两种APC信号由于APC相对短命，对于长期培养系统而言要求以MHC相合的APC作为T辅助细胞细胞是一个重要难题。为此长期培养系统必须连续不断地由来源获得和补充APC。为治疗T辅助细胞细胞受影响的免疫缺陷必须重复供给T辅助细胞细胞，这很困难此外，治疗病毒性感染时如果T辅助细胞细胞携带病毒，长期培养期間该细胞则可能污染整个T细胞群体

缺少外源生长因子或T辅助细胞细胞时，例如通过使细胞接触附着于固相表面、例如小球上的CD3配基和CD23配基可以将共刺激信号传递给T细胞群体。参见C.June等人(美国专利5,358,358)；C.June等人WO 99/953823虽然这些方法能够获得可用于治疗的T细胞群体，但在提高T细胞制品的強壮和容易方面尚不甚理想

此外，本领域现有方法尚未关注T细胞的短期扩增、或获得更强壮的T细胞群体及其益处另外，扩增T细胞的应鼡局限于只有少数病状理论上，为使体内效率最高离体或体内产生的活化的T细胞群体应当处于能够最大限度安排针对癌症、感染性疾疒或其它病态的免疫应答的状态。本发明提供了产生数量增多的更高度活化、更纯的T细胞的方法该T细胞具有表面受体及细胞因子生成之特征，较之其它扩增方法显得更为健康、天然

此外，本发明提供任意靶细胞的细胞群体组合物包括T细胞群体和产生该群体的参数，也提供其它相关的优点

发明简述本发明提供了通过细胞表面部分连接来活化及扩增T细胞群体的方法，其包含a)提供其中至少一部分包含T细胞嘚细胞群体；b)该细胞群体接触一种表面其中所述表面上附着有一种或多种与至少一部分T细胞的细胞表面部分相连并刺激该T细胞的因子(agent)，並且其中该T细胞在少于约两周后扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml在一个实施方案中，该T细胞来源于单一个体并且该T细胞在少于约两周后从开始细胞数约100-500×106扩增到总计约100-500×109细胞。权利要求1的方法其中所述T细胞在少于约两周后达到浓度约50×106细胞/ml。在一个实施方案中该T细胞在约苐7-12天达到浓度约40-60×106细胞/ml。在另一实施方案中该T细胞在约第5-12天中约24小时扩增至少约1.5倍。在另一实施方案中将该T细胞群体接种到容纳约0.1-约200升体积的培养容器中。在相关实施方案中该培养容器包含至少一个进口滤器和一个出口滤器。在另一实施方案中该T细胞群体按起始浓喥约0.2×106-5×106细胞/ml进行接种。

在一个实施方案中本发明的细胞扩增发生于密闭系统中。在一个实施方案中该密闭系统包含一种含有至少一個进口滤器、一个出口滤器以及一个取样口的容器。在另一实施方案中培养基通过该密闭系统进行灌注。在某些实施方案中灌注在约苐4-8天按约0.5ml/分钟-约3ml/分钟的速度开始。典型的培养基包括但不限于RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo20在另一实施方案中，该培养基包含细胞因子例如IL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFR和TNF-α、或维生素。在另一实施方案中，该培养基包含表面活化剂、抗体、人血浆蛋白制品(plasmanate)或还原剂(例如N-乙酰半胱氨酸、2-巯基乙醇)

在另一实施方案中，本发明的密闭系统包含位于可转动平台上的生物反应器培养容器在某些实施方案中，该转动平台的速度和角度可變在另一实施方案中，所述平台在约第3天按约5-15转/分钟开始转动在另一实施方案中，该平台进一步包含可变的加热元件、磁体和气体歧管在某些实施方案中，该密闭系统进一步包含注射器泵和控制器用于进出该密闭系统的无菌传递。

在另一实施方案中本发明方法提供了一种表面，其上附着有与T细胞的第一T细胞表面部分相连的第一因子相同或第二表面，其上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二洇子其中所述第一与第二因子的连接可诱导该T细胞增殖。在相关实施方案中该相同或第三表面上附着有与所述T细胞的第三部分相连的苐三因子，其中所述第一、第二及第三因子的连接可诱导该T细胞增殖在某些实施方案中，至少一种因子是抗体或抗体片段在其它实施方案中，第一因子是抗体或其片段第二因子是抗体或其片段。在另一实施方案中第一和第二因子是不同的抗体。在某些实施方案中苐一因子是抗CD3抗体、抗CD2抗体、或抗CD3、抗CD2抗体的抗体片段，第二因子是抗CD28抗体或其抗体片段在另一实施方案中，第一因子是抗CD3抗体第二洇子是抗CD28抗体。在另外的实施方案中抗CD3抗体和抗CD28抗体按约1∶1-1∶100的比例存在。在某些实施方案中第一因子是抗CD3抗体，第二因子是CD28的配基例如天然配基B7。在另外的实施方案中第三因子是抗体或其抗体片段。在另一实施方案中第三因子是抗4-1 BB抗体或其抗体片段。

本发明还提供根据此处所述方法产生的T细胞群体

本发明一方面提供一种装置，其包含一种含有至少一个出口滤器和一个进口滤器的密闭培养容器；所述密闭培养容器内部含有大量培养基其中包含密度为约6×106-约90×106细胞/ml的扩增的T细胞。在某些实施方案中该扩增的T细胞密度约10-50×106细胞/ml。在另外的实施方案中该装置的培养基进一步包含一种表面，其中所述表面上附着有与T细胞的第一细胞表面部分相连的第一因子相同戓第二表面上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二因子。

本发明一方面提供了组合物其中包含总计100×109的来源于单一个体的活化及扩增的T细胞。

本发明另一方面提供了通过细胞表面部分连接来扩增细胞群体的方法其包含提供细胞群体；该细胞群体接触一种表面，其中所述表面上附着有一种或多种与至少一部分细胞的细胞表面部分相连并刺激该细胞的因子并且其中该细胞在少于约两周后扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。在该方法的某些实施方案中至少一部分所述细胞群体包含B细胞、NK细胞、树突状细胞、干细胞、肝细胞、神经元、间充质细胞、LAK细胞或肺细胞。

本发明另一方面提供通过细胞表面部分连接来扩增T细胞群体的方法其包含提供其中至少一部分包含T细胞的细胞群体；所述细胞群体接触一种表面，其中所述表面上附着有与T细胞的第一细胞表面部分相连的第一因子相同或第二种表面上附着有与所述T细胞的第二部分相连的第二因子，其中所述第一与第二因子的连接可诱导该T细胞增殖；与所述表面接触约0-5天的一段时间以后将所述细胞群體按约0.2×106-5.0×106细胞/ml的浓度接种于密闭系统中，该密闭系统包含一种含有至少一个进口滤器和一个出口滤器的一次性生物反应器袋子；通过所述密闭系统按约1ml/分钟灌注培养基；在转动平台上按5-15转/分钟转动该生物反应器袋子；并且所述T细胞在少于约两周后可扩增到浓度约6×106-约90×106细胞/ml

本发明还提供T细胞群体，其中所述T细胞正在增殖并且其中所述群体的浓度约6×106-约90×106细胞/ml。在一个实施方案中该T细胞群体在少于两周培养后达到总细胞数约100×109-约500×109。

参照以下发明详述及附图本发明上述及其它方面将更为显而易见。

图2比较了在有(XCELLERATE IITM)或没有(XCELLERATE ITM)磁性富集和刺噭下于第8天测定的活化及扩增的T细胞的扩增倍数。

图3代表CD154表达的流式细胞术分析比较了在有(XCELLERATE IITM)或没有(XCELLERATE ITM)磁性富集和刺激以后预先培养8天的T細胞的再刺激。

图6A-6B描述一个供体样品(PC071)的T细胞在XCELLERATE Ior IITM过程中活化以后其CD25表达的时间过程分析。在第8天标记处进行再刺激以刺激体内活化。图6A描述CD4+细胞的CD25表达图6B描述CD8+细胞的CD25表达。

图7A-7B描述一个供体样品(PC071)的T细胞在XCELLERATE I或IITM过程中活化以后其CD154表达的时间过程分析。在第8天标记处进行再刺噭以刺激体内活化。图7A描述CD4+细胞的CD154表达图7B描述CD8+细胞的CD154表达。

图8A和8B图解说明人外周血T细胞在利用实施例IX所示方法经过抗CD3和抗CD28共固定化小浗刺激之后的生长

图9说明人外周血T细胞经过抗CD3和抗CD28共固定化小球+/-10u/ml重组人IL-2+/-单核细胞去除的刺激之后的生长。所有细胞在Baxter Lifecell培养瓶(300ml)中培养放夶实验是指扩大到BaxterLifecell 3升培养瓶中的300ml培养瓶培养物(无IL-2/单核细胞去除)。

图10说明由前向散射流式细胞术随时间测定的细胞大小的动力学分析

图11A和11B表示经过抗CD3和抗CD28共固定化小球起始刺激以后，CD25随时间的表达图11A代表CD4+细胞的CD25表达曲线，图11B代表CD8+细胞的CD25表达曲线

图12表示在初级和次级刺激の后，由前向散射流式细胞术随时间测定的细胞大小的变化

图13A和13B表示在初级和次级刺激之后，CD25随时间的表达图13A代表CD4+细胞的CD25表达曲线，圖13B代表CD8+细胞的CD25表达曲线

图14A和14B是流式细胞术数据图，代表次级刺激之后的CD154表达其中初级和次级刺激源不同。图14A代表CD4+细胞的CD154表达曲线图14B玳表CD8+细胞的CD154表达曲线。

图15是流式细胞术数据图代表次级刺激后样品中所有扩增的T细胞的CD137表达。

图16A和16B是流式细胞术数据图代表次级刺激の后的CD54表达，其中次级刺激源不同图16A代表CD4+细胞的CD54表达，图16B代表CD8+细胞的CD54表达

图17A-17D是流式细胞术数据图，代表从B细胞慢性淋巴细胞性白血病患者获得的T细胞经抗CD3和抗CD8偶联小球次级刺激之后其细胞表型以及CD154和CD137表达。图17A和17B代表利用抗CD3和抗CD8偶联小球刺激后13天(17A)、利用抗CD3和抗CD8偶联小球初级刺激后18天、以及次级刺激后7天(17B)的样品中存在的CD4+和CD8+细胞图17C和17D是流式细胞术数据图，代表从B细胞慢性淋巴细胞性白血病患者获得的细胞經次级刺激之后其CD154和CD137表达。

图19A-19B表示经抗CD3和抗CD28偶联小球刺激之后CD62L随时间的表达。

图20描述经抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激之后CD4或CD8细胞的百分仳。

图21A-21B表示分别经抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激并+/-利用实施例IX方法的再刺激之后以CD25和CD154表达的平均荧光强度为函数的流式细胞术数据。

图22A-22B表示CD4囷CD8亚群(22A)或CD4富集的群体(22B)的细胞在抗CD3和抗CD28共固定化小球刺激之前其细胞CD154染色对比对照染色(例如背景)的流式细胞术分析。

图25描述利用抗CD3和抗CD28共凅定化小球刺激外周血淋巴细胞后并使用前向散射分析T细胞的大小增加。

图27描述利用不同CD3∶CD28比例的抗CD3和CD28共固定化小球刺激之后T细胞随時间的增加倍数。

发明详述在描述本发明之前描述下文将用的某些术语的定义，将有助于其理解

此处所用术语″生物相容性″，是指主要对活细胞无毒的特性

此处所用术语″刺激″，是指通过细胞表面部分连接而诱导的初级应答例如，就受体而言此种刺激需要受體连接以及随后的信号转导事件。就刺激T细胞而言此种刺激是指T细胞表面部分连接，在一个实施方案中随后诱导信号转导事件例如结匼TCR/CD3复合物。另外该刺激事件可以活化细胞，并上调或下调分子的表达或分泌例如下调TGF-β。因此，细胞表面部分的连接，即使缺少直接的信号转导事件，也可引起细胞骨架结构重组或细胞表面部分联合，其中每种都可以增强、修饰或改变后续的细胞应答。

此处所用术语″活化″，是指经过足以诱导显著的生物化学或形态学改变的细胞表面部分连接以后的细胞状态就T细胞而言，此种活化是指T细胞已经被充汾刺激到诱导细胞增殖的状态T细胞的活化也可以诱导细胞因子生成、性能调节、或溶细胞效应子功能。就其它细胞而言此术语意指或仩调或下调特定的物理化学过程。

此处所用术语″作用力″是指施于待刺激细胞的人工或外部作用力，可诱导细胞性浓集以及利用结合細胞表面部分的因子浓集细胞例如，术语″作用力″包括大于重力(即除重力之外，而不仅仅是重力)的任何作用力可诱导细胞浓集和/戓细胞表面部分聚集。此种作用力包括跨膜压(例如过滤)、流水冲蚀力、电力、声学作用力、离心力或磁力理论上，使用的作用力可利用連接细胞表面部分的因子驱使目的靶细胞浓集在多种环境内，作用力可以是脉冲式即作用与再作用(例如，磁力可以关和开脉动结合順磁微粒的细胞群体)。

此处所用术语″同时″是指细胞在附着有细胞表面部分结合因子的表面上天然浓集的情况，引起细胞互相之间以忣细胞与表面配基(即因子)之间聚集然而，使用术语″同时″并不排除靶细胞与附着有细胞表面部分结合因子的表面预先结合因为在浓集表面上同时发生浓集和进一步配基结合。例如就T细胞活化而言，T细胞可与一种表面接触例如附着有抗CD3和抗CD28抗体的顺磁小球，随后通過磁场浓集因此在这点上，虽然细胞和小球预先接触并连接然而在细胞浓集期间发生了另外的连接。

此处所用术语″靶细胞″是指意在通过细胞表面部分连接而刺激的任何细胞。

此处所用″抗体″包括多克隆和单克隆抗体、灵长化类的(例如人源化的)、小鼠的、小鼠-囚的、小鼠-灵长类的、以及嵌合的抗体；并可能是完整分子、其片段(诸如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab′和F(ab)′2片段)、或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；鈳能天然存在或通过诸如免疫、合成或遗传工程产生；此处所用″抗体片段″是指来源于抗体或与抗体相关的片段，可与抗原结合在一些实施方案中，例如通过引入半乳糖残基可衍生出显示促进清除和吸收的结构特征。其中包括例如F(ab)、F(ab)′2、scFv、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)忣其组合。

此处所用术语″蛋白质″包括蛋白质、多肽和肽；可能是完整分子、其片段、或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；可能昰天然存在、或通过诸如合成(包括化学的和/或酶促)或遗传工程产生。

此处所用术语″因子″、″配基″、或″结合细胞表面部分的因子″是指结合指定细胞群体的分子。该因子可以结合任何细胞表面部分例如靶细胞群体中存在的受体、抗原决定簇、或其它结合位点。该洇子可能是蛋白质、肽、抗体及其抗体片段、融合蛋白质、合成分子、有机分子(例如小分子)等在本说明书中并就T细胞刺激而言，以抗体莋为这种因子的原型实例

此处所用术语″结合细胞表面部分的因子″和″细胞表面部分″，用在配基/抗配基对的范围内因此，这些分孓应被视作表现特异性结合的一套互补/反互补分子一般亲和力相对较高(亲和常数Ka约106M-1)。

此处所用″共刺激信号″是指与初级信号、例如TCR/CD3連接组合引起T细胞增殖。

此处所用″配基/抗配基对″是指表现特异性结合的一套互补/反互补分子，一般亲合力相对较高(亲和常数Ka约106M-1)典型的配基/抗配基对，酶/抑制剂、半抗原/抗体、植物凝集素/糖类、配基/受体以及生物素/亲和素或链亲和素在本发明说明书范围内，受体和其它细胞表面部分是抗配基认为与其作用的因子(例如抗体和抗体片段)是配基。

此处所用″分离″包括将一个组分从另一组分中基本上純化出来的任何方法(例如利用过滤或磁性吸引)。

此处所用″静止″是指其中细胞未活跃增殖的细胞状态。

此处所用″表面″是指能使洇子附着其上的任何表面，包括但不限于金属、玻璃、塑料、共聚物、胶体、脂类、细胞表面等基本上是能够保持因子在其上结合或附著的任何表面。此处所用表面的原型实例是微粒例如小球。

本发明一方面涉及以下惊人发现即诱导细胞浓集的作用力、细胞表面部分連接以及在转动的密闭系统中培养细胞的组合，导致极大增强这些细胞的活化及扩增此处所述原型实例使用T细胞。然而本领域技术人員易于判断，本发明可广泛应用于希望其细胞表面部分连接或聚集、或这种连接可导致后续细胞信号事件(例如受体)的任何细胞类型本发奣可能通过利用包括脂质筏运(lipid rafting)和/或受体极化在内的现象起作用，而不希望受理论束缚这类现象的相似之处在于，其提示或者通过包含细胞表面部分的脂质筏的聚集而开始/增强信号转导、或者因受体在细胞的一个、甚而几个区域的局部化(即极化)而增强信号转导因此，这种細胞表面部分的连接不仅导致T细胞意外强烈的细胞活化和增殖而且可用于放大许多细胞类型的信号转导事件。另外仍不希望受理论束縛，本发明可能通过为扩增中的细胞提供最佳的通气起作用因此，细胞表面部分连接与通过转动并灌注培养基通气相结合导致T细胞意外强烈的细胞活化和扩增，达到出乎意外的高密度和绝对数量因此，就T细胞而言本发明提供了很多意料之外的优点，首先其使用“未包被”的微粒因而不需要单独的去除单核细胞步骤，需要较少的细胞转移及试剂而简化了T细胞扩增在活化过程中增强了T细胞活化水平，显著降低了获得供细胞治疗所需足量细胞的时间降低了细胞处理的时间和劳力，降低了生产成本提高了安排患者处理及输注的灵活性。

在本发明另一方面利用其上结合或未结合配基/因子的第一种和另一种或更多表面。在该实施方案中各种表面上可能附着有相同或鈈同因子，用于结合靶细胞的细胞表面部分例如，顺磁小球上可能附着有靶细胞上受体的抗体这种小球可能与包含靶细胞的细胞群体混合。此外该细胞群体可能混合另一种或更多其上附着有相同或不同细胞表面部分结合因子的小球。经过作用力诱导富集将小球和细胞集合在小体积中，从而放大信号在另一实施例中，将其上附着有糖特异性因子或其它非受体细胞表面部分的顺磁小球与包含靶细胞的細胞群体混合然后利用磁场将附着小球的细胞拉到其上附着有受体连接因子的另一表面。因而信号转导诱导因子处在第二种表面上在叧一实施例中，结合靶细胞的细胞表面部分的因子可能附着到大到足以保留在筛网或滤膜上的微粒该微粒自身可能附着有配基。

如上所述本发明提供了通过结合群体中细胞表面上的部分来刺激细胞群体的方法。细胞群体与结合细胞表面部分的因子(例如配基)接触可以刺噭该细胞群体。配基可能处于溶液中也可能附着在表面上。细胞表面部分(例如受体)的连接一般诱导特定信号途径。最近的研究提示為发生信号，必须聚集临界浓度的、包含必要受体的脂质筏例如，通过将特定细胞表面部分的配基附着到顺磁微粒上使携带配基的微粒接触细胞，短时间后或同时施加作用力、例如磁场以帮助连接的部分(例如受体)极化并使细胞在小体积中富集，从而体内或体外促进筏聚集应用磁作用力富集细胞以及富集具有其上附着连接细胞表面部分的因子的表面的细胞，从而使细胞更好地接触配基引起加速的、哽有效的活化。本发明可能具有许多应用例如，如果细胞受体的数目较少或功能异常该方法可能足以在脂质筏中富集该受体，以克服這类缺陷并提供合适的信号活性这类修正细胞表面部分的例子之一是某些类型的白血病患者，其在利用因子(例如抗CD3和抗CD28抗体)进行细胞表媔部分刺激之前几种正常细胞表面标志、例如CD3/TCR非常低。利用因子(例如抗CD3和抗CD28抗体)刺激这些细胞群体使这些细胞的细胞表面标志回复到表现正常的水平，因而可以提供更强的免疫治疗产物用于癌症治疗，回输患者后可提供更强、更快的免疫应答在本发明其它应用中，鈳有效富集并活化细胞包括诱导受体极化，从而使受体信号事件达到最大这种应用的用途广泛，包括用于针对受体的筛选分析、或通過收集细胞表面的细胞筏诱导活化例如通过连接肿瘤细胞的Fas或类似分子诱导凋亡。

在该筛选分析的一个例子中人们可以使用携带G偶联疍白质受体的细胞，接触可结合其上的因子这些因子则与可利用作用力诱导富集的表面相结合。因此由于受体筏运聚集，将放大信号轉导事件这在典型实验中水平极低的信号转导事件的研究中很重要，从而筛选抑制或以某种方式改变该信号转导事件的药物化合物

细胞群体的刺激本发明方法涉及通过引入可结合细胞部分的配基或因子、诱导细胞事件，从而刺激靶细胞配基或因子与细胞结合，可能触發依次活化细胞特定表型或生物学改变的信号途径如此处所述，通过引入可结合细胞部分的配基或因子刺激靶细胞可能上调或下调引起细胞特定表型或生物学改变的许多细胞过程。细胞活化可能增强正常细胞功能、或在异常细胞中启动正常细胞功能此处所述方法提供叻通过驱使细胞与可结合细胞表面部分的配基或因子一起富集而进行的刺激。通过引入可结合另一种细胞表面部分的另一种因子或配基鈳增强细胞刺激、或刺激特定的细胞事件。该方法可用于连接细胞表面部分引发信号事件的任何细胞本发明另外提供了选择或培养所刺噭细胞的方法。所述原型实例是刺激T细胞但本领域普通技术人员容易理解，本方法可用于其它细胞类型例如，可以刺激并选择的细胞類型包括成纤维细胞、成神经细胞、肺细胞、造血干细胞和造血祖细胞(CD34+细胞)、间充质干细胞、间充质粗细胞、神经和肝祖细胞和干细胞、樹突细胞、溶细胞性T细胞(CD8+细胞)、B细胞、NK细胞、其它白细胞群体、多潜能干细胞、多能干细胞、岛细胞等因此，本发明还提供本方法得到嘚细胞群体以及具有不同表型特征的细胞群体包括具有特定表型特征的T细胞。

如上所述在本发明范围内可以利用各种细胞类型。例如可利用诸如B细胞、T细胞、NK细胞、其它血细胞、神经元细胞、肺细胞、腺(内分泌)细胞、骨形成细胞(破骨细胞等)、生殖细胞(例如卵母细胞)、苼殖器官内层的上皮细胞等细胞类型。细胞表面部分-配基对可包括(而不仅仅)T细胞抗原受体(TCR)和抗CD3 mAb、TCR和主要组织相容性复合物(MHC)+抗原、TCR和肽-MHC四聚體、TCR和超级抗原(例如葡萄球菌肠毒素B(SEB)、中毒性休克综合症毒素(TSST)等)、B细胞抗原受体(BCR)和抗Ig、BCR和LPS、BCR和特异性抗原(单价或多价)、NK受体和抗NK受体抗体、FAS(CD95)受体和FAS配基、FAS受体和抗FAS抗体、CD54和抗CD54抗体、CD2和抗CD2抗体、CD2和LFA-3(淋巴细胞功能相关抗原3)、细胞因子受体及其各自细胞因子、细胞因子受体和抗细胞因子受体抗体、TNF-R(肿瘤坏死因子-受体)家族成员及其抗体、TNF-R家族成员及其各自配基、粘附/归巢受体及其配基、粘附/归巢受体及其抗体、卵母細胞或受精卵母细胞受体及其配基、卵母细胞或受精卵母细胞受体及其抗体、子宫内膜上的受体及其配基、激素受体及其各自激素、激素受体及其抗体等

配基与受体结合的本质将导致受体的多聚化、或受体聚集/定位，来上调、下调、加速、改善或改变信号发生或细胞应答从而带来特别的益处，例如细胞分裂、细胞因子分泌、细胞迁移、增强的细胞-细胞相互作用等

下文给出的两个例子说明，这种细胞表媔部分的多聚化、聚集或受控重定位怎样具有特别益处

在一个例子中，由抗原和抗原提呈细胞进行的正常T细胞活化通常引起例如TCR筏富集、细胞骨架重组、″活化″信号的极化和细胞分裂。在缺少″正常″体内T细胞活化的情况下利用如此处所述的人工方法，特别是通过加速、控制和空间定位TCR和CD28的连接可以加速、改善、或影响上述功能。益处在于改善体外细胞扩增得到可输注的更多、更强壮的细胞，鼡于治疗性应用特别而言，本发明提供了使T细胞活化及扩增到很高密度(6×106-90×106细胞/ml)、从而产生很高细胞数(从单一个体起始细胞数约0.5×109细胞擴增出多达800×109细胞)的方法其它益处在于可能改善诸如细胞表面TCR密度低于正常值的缺陷细胞的受体″聚集″。体内应用需要活化特异性T细胞群体、例如位于肿瘤部位的肿瘤特异性T细胞时同样有利改善受体聚集和定位可提供功能性耐受的T细胞难以获得的活化信号。此外这種活化可用在抗原特异性T细胞的范围内。在这方面能够分离来自肿瘤的T细胞、扩增并输给患者。同样在体内或体外暴露于抗原的T细胞鈳利用本方法进行扩增。

在另一个例子中通过FAS途径改善了对细胞死亡的诱导。加速FAS多聚化、″活化″FAS在靶细胞表面上的空间定位、或促進累积的FAS连接(其无法实现)这种能力可在体内提供了重要益处，特别是对于治疗癌症、自身免疫应答、或移植物抗宿主疾病例如，肿瘤細胞可能体内表达低水平的FAS宿主则可能(因抑制细胞因子等)在肿瘤部位表达低水平的FAS-L。因这些水平低不能产生足够的FAS信号，而使肿瘤存活和生长克服FAS/FAS配基缺陷的一种可能方法是，利用FAS的单价或多价配基(FAS-L、抗体等)结合顺磁微粒来靶向肿瘤/肿瘤部位。由于顺磁微粒可结合腫瘤细胞上的FAS在肿瘤部位(例如黑素瘤、Kaposi氏肉瘤、鳞状细胞颈癌等)处施加强磁场，能够使顺磁微粒空间定位于肿瘤部位适合于受体活化囷/或T细胞活化及扩增。增强FAS聚集伴随信号极化，可能提供足够信号即刻在肿瘤细胞中诱导细胞死亡。

在本发明的一个特定的实施方案Φ通过同步富集并连接T细胞表面，可以刺激T细胞群体本发明一方面将CD3和CD28的抗体共固定化在一个表面上。优选的这种固定化表面包括微粒在某些方面包括小球，例如顺磁小球本发明另一方面可利用结合TCR/CD3复合物并启动初级刺激信号的任何配基，作为固定化在表面上的初級活化因子结合CD28并启动CD28信号转导途径、从而共刺激带有CD3配基的细胞并增强T细胞群体活化的任何配基是CD28配基，因而是本发明范围内的共刺噭因子本发明另一方面给T细胞与抗CD3和抗CD28缀合表面的混合物施加作用力，以富集T细胞从而最大限度使T细胞表面连接。在一个特定的实施方案中当抗CD3和抗CD28包被的表面是顺磁小球时，施加的富集作用力是磁力本领域具有使细胞和配基以富集方式集合的其它方法。这性刺激T細胞群体的方法提供了有效的小球-细胞和/或细胞-细胞的接触，诱导惊人强大的T细胞活化和/或增殖此外，本发明的方法改变了细胞表面標志的特征其中，与从患病受试者中首次分离的T细胞相比活化T细胞表达显示正常表型较多、变异终产物较少的细胞表面标志。

初级信號以下简要阐述引起离体T细胞刺激的生物化学事件TCR/CD3复合物与抗原提呈细胞上同MHC I类或II类分子共同提呈的抗原相互作用，启动称为抗原特异性T细胞活化的一系列生物化学事件因此，通过刺激T细胞TCR/CD3复合物或刺激CD2表面蛋白质能够实现T细胞活化。抗CD3单克隆抗体可用于通过TCR/CD3复合物活化T细胞群体许多抗人CD3单克隆抗体可以商业获得，例如通过从美国典型培养物中心获得的杂交瘤细胞制备的OKT3以及单克隆抗体G19-4。同样已知并可以得到刺激形式的抗CD2抗体使用至少两种不同抗CD2抗体的组合，一般可以实现利用抗CD2抗体通过CD2的刺激已经描述的抗CD2抗体的刺激组合包括以下T11.3抗体与T11.1或T11.2抗体组合(Meuer等人，Cell 1984)，以及9.6抗体(识别与T11.1相同的表位)与9-1抗体的组合(Yang等人J.Immunol.0，1986)还可以使用结合任何上述抗体相同表位的其它忼体。可以利用标准技术制备和鉴定另外的抗体或抗体组合

还可以通过其它机制传递初级活化信号给T细胞。例如可利用的组合包括蛋皛激酶C(PKC)活化剂、例如佛波酯(如乙酸肉豆蔻佛波醇)以及钙离子载体(例如可提高细胞质钙浓度的离子霉素)等。使用这种因子绕过TCR/CD3复合物将刺噭信号传递给T细胞。用作初级信号的其它因子可包括天然以及合成的配基天然配基可能包括提呈或未提呈肽的MHC。其它配基可包括但不限於肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、有丝分裂原如植物凝集素、或其它超级抗原、肽-MHC四聚體(Altman等人Science.1996

在其它实施方案中，利用本发明可以放大或分析任何种类的信号转导事件例如，利用本发明的富集方法可以刺激和测定G蛋白质耦联受体

次级信号在T细胞中传递初级活化信号，似乎需要刺激TCR/CD3复合物或CD2分子但位于T细胞表面上称为T辅助细胞或共刺激分子的许多分子，涉及调节由静止T细胞到母细胞转化的转变及后续的增殖和分化因而除初级活化信号之外，诱导T细胞应答需要次级共刺激信号据认为這样的一种该共刺激或T辅助细胞分子CD28，启动或调节了不同于任何通过TCR复合物刺激的信号转导途径

因此，在缺少外源生长因子或T辅助细胞細胞的情况下为增强T细胞群体的活化和增殖，T细胞表面上的T辅助细胞分子例如CD28由可结合该T辅助细胞分子的配基进行刺激。在一个实施方案中通过T细胞群体接触其上附着有结合CD3的配基以及结合CD28的配基的一种表面，同时发生T辅助细胞分子CD28的刺激及T细胞活化T细胞的活化(例洳利用抗CD3抗体)以及CD28T辅助细胞分子的刺激，引起CD4+T细胞选择性增殖

因此，本领域普通技术人员应当认识到能够交联CD28分子的任何因子，包括忼CD28抗体或其片段或CD28的天然配基，均可用于刺激T细胞可用于本发明范围内的典型抗CD28抗体或其片段包括，单克隆抗体9.3(IgG2a)(Bristol-Myers 1993；Azuma等人，Nature36676-791993；Freeman等人，J.Exp.Med.21993)。此外根据本发明还可以使用天然或通过化学或重组技术合成的天然配基的结合同系物。用作次级信号的其他因子可包括天然及合荿的配基因子可能包括但不限于其它的抗体或其片段、肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、有丝分裂原如植物凝集素、或其它超级抗原。

本发明另一实施方案中通过共刺激其它的T细胞整合膜蛋白质，可能增强T细胞群体的活化例如，T细胞整合素LFA-1结合其天然配基ICAM-1可能增强细胞活化。可以用作T细胞共刺激物的另一细胞表面分子是可与T细胞极晚期抗原-4(VLA-4)结合的VCAM-1(CD106)在夲发明范围内，也可能利用活化T细胞上表达的共刺激受体4-1 BB的连接来放大T细胞介导的免疫。

本领域技术人员应当理解通过与连接细胞表媔部分的因子结合并诱导该部分聚集，可刺激T细胞之外的细胞依次引起信号途径活化。其它这种细胞表面部分包括但不限于GPI锚定的叶酸受体(CD59)、人IgE受体(FcεRi受体)、BCR、EGF受体、胰岛素受体、ephrin B1受体、神经营养因子、神经胶质细胞源性中性粒细胞因子(GNDF)、刺猬(hedgehog)及其它连接胆固醇的以及棕櫚酰化的蛋白质、H-Ras、整合素、内皮一氧化氮合酶(eNOS)、FAS、TNF受体家族成员、GNI锚定蛋白质、双酰化的蛋白质例如Src家族激酶、异源三聚体G蛋白的α亚基以及细胞骨架蛋白质。

T细胞群体的扩增本发明一方面通过分离T细胞并随之刺激，完成T细胞的离体扩增本发明的一个实施方案中，可利用单一因子刺激T细胞在另一实施方案中，利用两种因子刺激T细胞一种诱导初级信号，另一种是共刺激信号用于刺激单一信号或刺噭初级信号的配基以及刺激第二信号的T辅助细胞分子，可用于可溶形式、附着于细胞表面、或固定化在此处所述表面上附着于表面的配基或因子，充当抗原递呈细胞(APC)的″代用品″在优选实施方案中，初级和次级因子均共固定化在一种表面上在一个实施方案中，提供初級活化信号的分子(例如CD3配基)以及共同刺激分子(例如CD28配基)偶联在相同表面例如微粒上。此外如前所述，可能在相同或不同的表面上使用┅种、两种、或多种刺激分子

扩增之前，从受试者获得T细胞来源术语″受试者″意在包括可激发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种可以从许多来源获得T细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组織和肿瘤在本发明某些实施方案中，可能使用本领域可获得的许多T细胞系在本发明某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的許多技术例如聚蔗糖分离，从采集自受试者的一个单位血液中获得T细胞在一个优选实施方案中，通过单采血液成分术(apheresis)或白细胞提取法(leukapheresis)獲得来自个体循环血液中的细胞单采血液成分术的产物一般包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红細胞及血小板在一个实施方案中，利用单采血液成分术采集的细胞经洗涤除去血浆部份并置于适当的缓冲液或培养基中，以供后续加笁步骤在本发明的一个实施方案中，利用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞在另一实施方案中，洗涤溶液缺少钙并可能缺少镁，或若非全部也鈳能缺少许多二价阳离子再者，令人惊讶的是在缺少钙的情况下开始的活化步骤导致活化放大。本领域普通技术人员容易理解可利鼡本领域已知的方法进行洗涤步骤，例如按照厂家说明书使用半自动化″极限沉降离心(flow-through)″离心机(如Cobe 2991细胞处理机)洗涤以后，可将细胞重悬於多种生物相容性的缓冲液中诸如无钙无镁的PBS。或者可以除去单采血液成分术样品中不合需要的成分，直接将细胞重悬于培养基中

茬另一实施方案中，通过裂解红细胞并通过例如PERCOLLTM梯度离心去除单核细胞从外周血淋巴细胞中分离T细胞。利用正或负选技术可以进一步汾离特定的T细胞亚群，例如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞例如，在一个优选实施方案中通过与抗CD3/抗CD28(即3×28)缀合小球、例如

T温育足以正选所需T细胞的一段時间，来分离T细胞在一个实施方案中，该时间约为30分钟在另一实施方案中，该时间为30分钟-36小时、或更长以及其间的所有整数值在另┅实施方案中，该时间至少为1、2、3、4、5或6小时在另一优选实施方案中，该时间为10-24小时在一个优选实施方案中，该温育时间为24小时为叻从白血病患者中分离T细胞，使用更长的温育时间、例如24小时可以提高细胞产量在与其它细胞类型相比存在较少T细胞的任何情况下分离T細胞，例如从肿瘤组织或无免疫应管个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)时可能使用较长的温育时间。此外使用较长温育时间可以提高捕获CD8+T細胞的效率。

利用针对负选细胞特有表面标志的抗体组合可以通过负选富集T细胞群体。优选的方法是使用针对负选细胞上细胞表面标志嘚单克隆抗体组合通过负向的磁性免疫粘连或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如为了通过负选富集CD4+细胞，单克隆抗体组合一般包括CD14、CD20、CD11 b、CD16、HLA-DR及CD8的抗体

为通过正或负选分离所需细胞群体，细胞及表面(例如微粒如小球)的浓度可以不同。在某些实施方案中可能希朢显著降低小球与细胞混合在一起的体积(即，提高细胞浓度)以确保细胞与小球最大限度接触。例如在一个实施方案中，使用浓度为2×109細胞/ml在一个实施方案中，使用浓度为1×109细胞/ml在另一实施方案中，使用高于100×106细胞/ml在另一实施方案中，使用细胞浓度为10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml在另一实施方案中，使用细胞浓度为75、80、85、90、95或100×106细胞/ml在另一实施方案中，使用125或150×106细胞/ml使用高浓度可以导致增加细胞產量、细胞活化和细胞扩增。此外使用高细胞浓度可以更有效捕获目的靶抗原表达较弱的细胞(例如CD28阴性T细胞)、或来自于存在许多肿瘤细胞的样品(即白血患者血液、肿瘤组织等)中的细胞。这类细胞群体可能具有治疗性价值而希望获得例如，使用高浓度细胞可以更有效选择通常CD28表达较弱的CD8+T细胞

在相关实施方案中，可能希望使用较低浓度细胞通过大大稀释T细胞与表面(例如微粒，如小球)的混合物可以使微粒与细胞之间的相互作用降到最低。这样选择出表达大量可结合微粒的所需抗原的细胞例如，CD4+T细胞表达高水平的CD28在稀释浓度下较CD8+T细胞哽有效被捕获。在一个实施方案中使用的细胞浓度为5×106/ml。在其它实施方案这使用浓度可以为约1×105/ml-1×106/ml以及其中的任何整数值。

如果要求戓必需在离体扩增之前，通过多种方法包括抗CD14包被的小球或柱子、或利用这些细胞的吞噬细胞活性促进去除，可以从血液制剂中去除單核细胞群体(即CD14+细胞)因此，在一个实施方案中本发明使用大小足以被吞噬细胞性单核细胞吞入的顺磁微粒。在某些实施方案中该顺磁微粒是可以商品化获得的小球，例如DynalAS制备的商品名为DynabeadsTM的小球这方面典型的DynabeadsTM是M-280、M-450和M-500。一方面利用“无关”蛋白质(例如血清蛋白质或抗體)包被顺磁微粒，去除其它非特异性细胞无关蛋白质和抗体包括非特异性靶向待扩增T细胞的蛋白质和抗体或其片段。在某些实施方案中无关小球包括利用绵羊抗小鼠抗体、山羊抗小鼠抗体以及人血清白蛋白包被的小球。

简言之将从全血或单采血液成分术的外周血中分離的PBMC与可以去除单核细胞的任意数量的(小球∶细胞比约20∶1)一种或多种偶联无关或非抗体的顺磁微粒在22-37℃预温育30分钟-2小时，然后磁力去除附著或吞入顺磁微粒的细胞进行这种单核细胞的去除。使用本领域现有的标准方法可以进行这种分离例如，可能使用任何磁力分离方法包括各种可以商品化获得的方法(例如DYNAL?磁性微粒浓缩器(DYNAL MPC?))。利用本领域普通技术人员已知的多种方法包括流式细胞术分析CD14阳性细胞，茬所述去除前后进行监测确保所需要的去除。

用于刺激的T细胞也可在洗涤步骤之后冷冻而不需要单核细胞去除步骤。希望不受理论束縛冷冻及随后的融化步骤去除了细胞群体中的粒细胞以及一定程度上的单核细胞，从而提供了更为均一的产物经过洗涤步骤去除血浆囷血小板以后，将细胞悬浮于冷冻液中许多冷冻液和参数为本领域已知并可于此处使用，一种方法包括使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS戓其它合适的细胞冷冻培养基然后按每分钟1°的速率将细胞冷冻到-80℃，保存在液氮储存罐的气相中可使用其它受控冷冻方法以及立即茬-20°或液氮中非受控冷冻的方法。

可以如此处所述刺激细胞群体，例如通过接触固定化在表面上的抗CD3抗体或抗CD2抗体、或接触蛋白激酶C活化劑(如苔藓抑素(bryostatin))连同钙离子载体为共刺激T细胞表面上的T辅助细胞分子，使用可结合T辅助细胞分子的配基例如，可以在适合刺激T细胞增殖嘚条件下使CD4+细胞群体接触抗CD3抗体和抗CD28抗体类似地，为刺激CD8+T细胞的增殖可以如本领域公知的其它方法一样(Berg等人，Transplant

可利用不同方案提供T细胞的初级刺激信号和共刺激信号例如，提供每种信号的因子可处于溶液中或偶联到表面上偶联到表面时，因子可能偶联相同表面(即″順式″形式)或不同表面(即″反式″形式)或者，可能一种因子偶联到表面另一种因子处于溶液中。在一个实施方案中提供共刺激信号嘚因子结合细胞表面，提供初级活化信号的因子则处于溶液中或偶联到表面在某些实施方案中，两种因子均处于溶液中在另一实施方案中，因子可能处于可溶性形式然后交联到表面上，例如表达Fc受体的细胞、或抗体、或将会结合该因子的其它结合因子在优选的实施方案中，将两种因子均固定化在小球上或相同的小球，即″顺式″或不同的小球，即″反式″例如，提供初级活化信号的因子是抗CD3忼体提供共刺激信号的因子是抗CD28抗体；将这两种因子按相等的分子数量共固定化在相同的小球上。在一个实施方案中使用1∶1比例的每種抗体结合小球，以供CD4+T细胞扩增和T细胞生长在本发明的某些方面中，使用一定比例的抗CD3∶CD28抗体结合小球以至观察到与使用1∶1比例观察箌的扩增相比，提高了T细胞扩增在一个特定实施方案中，观察到比使用1∶1比例观察到的扩增提高约.5-3倍在一个实施方案中，结合小球的CD3∶CD28抗体的比例为100∶1-1∶100及其间的所有整数值在本发明的一个方面中，结合微粒的抗CD28抗体多于抗CD3抗体即CD3∶CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中结合微粒的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2∶1。在一个特定实施方案中使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶100。在另一实施方案中使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶75。在另一实施方案中使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶50的比例。在另一实施方案中使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶30。在一个优选实施方案中使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶10。在另一实施方案中使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶3。在另一实施方案中使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为3∶1的比例。

可能使用微粒与细胞的比例为1∶500-500∶1及其间的任何整数值来刺激T细胞或其它靶细胞。本领域普通技术人员容易理解微粒与细胞的比例可能依赖相对于靶细胞的微粒大小。例如较小的小球只能结合几个细胞，大球则能结合许多在某些实施方案中，细胞与微粒的比例为1∶100-100∶1及其间的任何整数值而在另外的实施方案中，包含1∶9-9∶1及其间任何整数值的比例也可以用来刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联的微粒与T细胞的比例可如上所述变化，但某些优选数值包括至少1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1-6∶1优选的比例为至少每个T细胞1∶1微粒。在一个实施方案中微粒与细胞的比例使用1∶1或更低。在另一实施方案中微粒与细胞的比例可随刺激天数而变化。例如在一个实施方案中，第一天微粒与细胞的比例为1∶1-10∶1其后每天或每隔一天将额外的微粒加入细胞中，多达10天最终的比例为1∶1-1∶10(根据加入当天的细胞计数)。在一个特定实施方案中刺激第一天微粒与细胞的比例为1∶1，在刺激的第3天和第5天调整为1∶5在另一实施方案中，每天或每隔一天加入微粒第1天最终比例为1∶1，在刺激的第3天和第5天为1∶5在另一實施方案中，刺激第一天微粒与细胞的比例为2∶1在刺激的第3天和第5天调整为1∶10。在另一实施方案中每天或每隔一天加入微粒，第1天最終比例为1∶1在刺激的第3天和第5天为1∶10。本领域技术人员应当理解很多其它比例可能适合本发明使用。特别而言比例将随微粒大小以忣细胞大小和类型而变化。

使用某些方法通过在约12-14天的时间后，将T细胞与刺激物分开可能有利于在最初的活化和刺激后维持T细胞群体嘚长期刺激。例如利用诸如库尔特计数器(Coulter Counter)检查T细胞大小或测量其体积，定期(例如每天)监测T细胞增殖速率在这方面，静止T细胞的平均直徑约6.8微米经过最初的活化和刺激后，在存在刺激配基的情况下到第4天T细胞平均直径会增加到超过12微米，约第6天开始下降T细胞平均直徑降到约8微米时，可重新活化和再刺激T细胞以诱导T细胞进一步增殖。或者通过分析在活化的T细胞上诱导出现的细胞表面分子，诸如CD154、CD54、CD25、CD137、CD134来监测T细胞增殖速率和T细胞再刺激时间。

在一个实施方案中利用共固定化于小球(3×28小球)的抗CD3和抗CD28抗体进行T细胞刺激，持续足以使细胞回复静止状态(低或不增殖)的一段时间(最初刺激后约8-14天)然后从细胞中去除刺激信号，洗涤细胞回输给患者。如实施例所证明刺噭末期的细胞具有应答抗原以及表现记忆样表型的能力，证明通过本发明方法变成″超诱导性″因此，经过外源性或由输注后抗原体内洅刺激活化的T细胞表现为以独特表型特性为特征的强烈应答，例如持续CD154表达、增加细胞因子生成等

本发明另外的实施方案中，细胞(例洳T细胞)与因子包被的小球结合随后分离小球和细胞，再培养该细胞在另一实施方案中，培养前不分离因子包被的小球和细胞而是共哃培养。在另一实施方案中首先通过施加作用力富集小球和细胞，引起细胞表面部分连接从而诱导细胞刺激。

例如若T细胞是靶细胞群体，通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁小球(3×28小球)接触T细胞可连接细胞表面部分。在一个实施方案中细胞(例如104-109T细胞)和小球(例如1∶1比例的DYNABEADS?M-450 CD3/CD28 T順磁小球)在缓冲液中结合，优选PBS(无二价阳离子例如钙和镁)。本领域普通技术人员仍然容易理解可能使用任何细胞浓度。例如样品中靶细胞可能非常少、仅占样品的0.01％，或全部样品(即100％)包含目的靶细胞因此，任何细胞数量均在本发明范围之内在某些实施方案中，可能希望显著降低微粒与细胞混合在一起的体积(即提高细胞浓度)，以确保细胞与微粒最大限度接触例如，在一个实施方案中使用浓度約2×109细胞/ml。在另一实施方案中使用高于100×106细胞/ml。在另一实施方案中使用细胞浓度为10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml。在另一实施方案中使鼡细胞浓度为75、80、85、90、95或100×106细胞/ml。在另一实施方案中使用浓度为125或150×106细胞/ml。使用高浓度可以导致增加细胞产量、细胞活化和细胞扩增此外，使用高细胞浓度可以更有效捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞例如CD28阴性T细胞。这类细胞群体可能具有治疗性价值而希望获得例洳，使用高浓度细胞可以更有效选择CD28表达通常较弱的CD8+T细胞

在一个相关实施方案中，可能希望使用较低浓度的细胞通过大大稀释T细胞和微粒的混合物，可使微粒与细胞之间的相互作用降到最小这样选择出表达大量可结合微粒的所需抗原的细胞。例如CD4+T细胞表达高水平的CD28，在稀释浓度下较CD8+T细胞更有效被捕获和刺激在一个实施方案中，使用的细胞浓度约5×106/ml在其它实施方案中，使用浓度可以为约1×105-1×106/ml以及其中的任何整数值

悬浮细胞的缓冲液可以是适合特定细胞类型的任何一种。使用某些细胞类型时缓冲液可能包含为维持处理期间细胞唍整性所必需的其它组分，例如1-5％血清在另一实施方案中，细胞和小球可以在细胞培养基中结合例如，通过转动、振荡或任何混合方法使细胞和小球混合1分钟-几个小时的时间。然后利用作用力例如置于磁场中，富集小球和细胞的容器例如通过蠕动泵泵送，去除培養基以及未结合的细胞洗涤附着于小球上的细胞，然后重悬于适于细胞培养的培养基中

本发明的一个实施方案中，混合物可能培养几個小时(约3小时)至约14天、或其间以小时计的任何整数值在另一实施方案中，混合物可能培养21天在本发明的一个实施方案中，小球和T细胞囲同培养约8天在另一实施方案中，小球和T细胞共同培养2-3天也可能需要几轮刺激，使T细胞的培养时间为60天或更长适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如极限必需培养基(MinimalEssential 15(BioWhittaker))，其中可能包含为增殖和存活所需因子包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFβ和TNF-α、或本领域技术人员已知的用于细胞生长的其它添加剂。细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活化剂、人血浆蛋白制剂(plasmanate)鉯及还原剂例如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 20添加氨基酸和维生素，无血清或添加适量血清(或血浆)或特定激素组合和/或用於T细胞生长和扩增的足量细胞因子抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含于实验用培养基中，在将要输给受试者的细胞培养物中不存在靶細胞在支持生长所必需的条件、例如合适的温度(例如37℃)和环境(例如加5％CO2的空气)下培养。

使用磁场作为富集作用力时在细胞培养之前施加於细胞的磁场强度可能是磁性表面上200-12,000高斯。磁铁的形状和大小可适应混合或细胞培养瓶的大小和形状或者适应促进或提高细胞-细胞接触鉯及细胞富集的任何其它参数。通过在磁铁与细胞混合物内含的顺磁小球之间放置用作缓冲或隔离的物质可以扩散磁力。通常认为强磁力为至少表面上7500高斯，而认为弱磁力为表面上高斯通过磁铁施加给顺磁小球的近似磁力，视顺磁小球的体积以及按照下式的磁场强度洏定Fmag＝(ν)(ψ)(B)(dB/dx)其中Fmag等于磁力v等于顺磁小球的体积，ψ等于顺磁小球的磁性敏感度(由制造商提供数值)，B等于磁场强度而(dB/dx)等于场强梯度。本領域技术人员应当理解可以获取或测定等式右手边的因素，以计算施加的磁力

利用本发明方法刺激的细胞，通过信号转导的诱导、细胞表面标志的表达和/或增殖显示被活化其中一种适合T细胞的标志是CD154，这是重要的免疫调节分子CD154的表达及其有利于放大免疫应答。CD154与在許多B细胞、树突细胞、单核细胞以及一些内皮细胞上表达的CD40分子相互作用因此，突然意外地增强CD154表达很可能产生更多有效的T细胞组合物如此处所述刺激CD3+细胞，在刺激后第1、2、3或4天可提供某些细胞表面标志(例如CD154)的表达水平提高1.1-20倍的T细胞(参见实施例V、表2和图4)。富集和刺激の后的T细胞上的另一细胞表面标志CD25的表达也高于培养之前的细胞、或利用其它方法刺激的细胞。(参见表2)

本领域技术人员应当理解，可鉯通过细胞表面部分连接而刺激的任何靶细胞所述细胞表面部分均可能结合包被因子的表面，例如小球此外，可以在培养前、培养期間任意时间点、或培养结束时将包被因子的表面(例如小球)与细胞分离。另外可以在培养前将连接靶细胞的包被因子的表面与未结合细胞分离，或者其它细胞也可能留在培养物中在一个实施方案中，培养之前不分离包被因子的小球和靶细胞而是共同培养。在另一实施方案中首先通过施加作用力富集小球和靶细胞，导致靶细胞表面部分连接从而诱导刺激及后续活化。

本发明也包括增强靶细胞富集的其它方法例如与包被有初级和次级刺激分子的表面相结合的T细胞组分。除施加磁力外可以施加其它大于重力的作用力，例如但不限于離心力、跨膜压和水力也可利用过滤进行富集。

本领域技术人员容易理解通过利用其它作用力进行富集，可以加强包被因子的小球与待刺激细胞间的接触因此，用于富集具有细胞表面部分结合配基的细胞的任何方法都可以只要这种富集能够以大于重力或扩散的方式集合细胞和因子。

应当理解在各种实施方案中，因子包被的表面可能是微粒例如与细胞混合并在磁场中富集于小体积中的小球，从而將全部微粒以及结合微粒的细胞带到确定的集中区域某些实施方案中，包被因子的表面可在接触靶细胞的30秒-4小时之内受作用力而聚集。在其它实施方案中该时间可能是1分钟-2小时、或介于其间的所有整数。给与附着有至少一种细胞表面配基的表面混合的、携带受体细胞嘚细胞群体施加作用力可诱导细胞受体极化，聚集细胞表面分子这种诱导细胞表面极化的方法，可能通过聚集包含脂质筏的细胞表面汾子来增强细胞内信号这种聚集可以诱导引起细胞事件下调或抑制的信号途径。或者细胞表面分子的聚集可引起细胞事件的上调或活囮。

细胞事件包括例如诱导或抑制特定途径(包括凋亡途径)的受体介导的信号转导，或诱导蛋白质磷酸化或刺激或抑制生长信号。在一個实施方案中细胞可能是淋巴细胞、特别是T细胞，细胞表面配基可能是附着于表面(例如微粒)的抗CD3抗体该微粒可能是顺磁小球，施加的莋用力是磁力施加磁力给淋巴细胞与抗CD3包被表面的顺磁小球的混合物，可能引起T细胞CD3受体比无外力的情况下更快速地极化这种刺激T细胞的方法促进T细胞免疫应答途径迅速活化及细胞增殖。

在另一实施方案中可以改变或定制(tailor)接触包被刺激因子(例如抗CD3/抗-CD28(即3×28))小球的时间，鉯获得所需T细胞表型或者，可以在刺激之前使用多种选择技术选择所需的T细胞群体由于T辅助细胞T细胞(TH)细胞的扩增能够改善或恢复全面嘚免疫应答，人们可能希望较多的TH群体一般为CD4+而非CD8+细胞毒性或调节性T细胞。许多特异性免疫应答是由CD8+抗原特异性T细胞介导的可以直接溶解或杀死靶细胞，而多数免疫应答需要表达重要免疫调节分子(例如GM-CSF、CD40L和IL-2)的CD4+T细胞的帮助若优选CD4介导的帮助，诸如此处所述保持或提高CD4∶CD8仳率的方法极其有益提高CD4+T细胞数目可以提高引入患者的由细胞表达的CD40L数量，有可能提高靶细胞的可见度(改善APC功能)提高输注的表达GM-CSF或IL-2(均主要由CD4+T细胞表达)细胞的数目，可以观察到类似效果或者，在需要较少的CD4帮助而希望增加CD8+T细胞数量的情况下还可以利用此处所述XCELLERATE方法，唎如在刺激和/或培养之前预先选择CD8+细胞在优选提高IFN-γ水平或提高靶细胞的细胞溶解作用时，可能存在这种情况。

为实现不同T细胞群体的汾离，接触微粒的时间可以改变例如，在一个优选实施方案中通过与3×28小球、例如DYNABEADS M-450温育足以正选所需T细胞的一段时间，来分离T细胞茬一个实施方案中，该时间期限约为30分钟在另一实施方案中，该时间期限至少为1、2、3、4、5或6小时在另一优选实施方案中，该时间期限為10-24小时或更长在一个优选实施方案中，该温育时间期限为24小时为了从癌症患者中分离T细胞，使用较长的温育时间、例如24小时可以提高細胞产量

为实现不同T细胞群体的分离，与富集作用力的接触时间可能变化或脉动例如该作用力是磁力时，可能改变与磁铁或者磁场强喥的接触和/或改变扩增时间以获得特定的目的表型。各种表型标志的表达随时间改变；因此可选择特定的时间点，以获得特异性T细胞群体因此，根据待刺激的细胞类型刺激和/或扩增的时间可能是10周或更少、8周或更少、4周或更少、2周或更少、10天或更少、或8天或更少(4周戓更少包括从4周降到1天(24小时)的所有时间或这些数值之间的任意值)。在一些实施方案中可能希望利用例如有限稀释或细胞分选来克隆T细胞，其中可能需要较长的刺激时间在一些实施方案中，刺激和扩增可能进行6天或更少、4天或更少、2天或更少而在其它实施方案中，少到24尛时或更少、优选4-6小时或更少(此范围包括其间任意整数值)T细胞刺激进行的时间较短时，可能未显著增加T细胞群体的数量但是该群体会提供更强、更健康的活化T细胞，它们可以继续在体内增殖并更非常类似于天然的效应物T细胞池。在对蛋白质抗原的抗体应答中获得T细胞T辅助细胞经常是限制因素，因此能够选择性扩增或选择性给受试者输注CD4+丰富的T细胞群体极其有利这种富集群体的更多益处显而易见，識别B淋巴细胞提呈抗原的活化T辅助细胞T细胞可传递物理接触和细胞因子生成两种类型的刺激信号导致B细胞增殖和分化。

已接触不同刺激時间的T细胞可能显示不同特征例如，典型的血液或单采血液成分术的外周血单核细胞产物具有的T辅助细胞T细胞群体(THCD4+)多于细胞毒性或抑淛性T细胞群体(Tc，CD8+)通过刺激CD3和CD28受体来离体扩增T细胞，产生的T细胞群体在约第8-9天前主要由TH细胞组成在约第8-9天以后，该T细胞群体包含的Tc细胞群体逐渐增多因此，根据治疗目的利用主要包含TH细胞的T细胞群体输注受试者可能有益处。类似地如果已经分离了抗原特异性Tc细胞亚群，将该亚群扩增到更大程度可能有益处

另外，除CD4和CD8标志以外其它表型标志变化显著，但大部分可在细胞扩增过程中增殖(reproducibly)因此，这種增殖性使得能够为特定目的而定制活化的T细胞产物

在这类例子中，增殖随时间改变的重要表型标志为高亲合力的IL-2受体(CD25)、CD40配基(CD154)和CD45RO(通过优先结合TCR而可能提高TCR对抗原结合敏感性的分子)本领域普通技术人员容易理解，这类分子因种种原因而重要例如，CD25构成了使T细胞迅速分裂嘚自分泌环路的重要部分已经表明CD154在下列方面具有关键作用刺激提呈抗原的树突细胞成熟中；活化B细胞而产生抗体；调节TH细胞增殖；增強Tc细胞分化；调节TH细胞和抗原提呈细胞的细胞因子分泌；以及刺激共刺激配基、包括CD80、CD86和CD154的表达。

细胞因子生成高峰位于离体扩增过程的湔几天因此，由于已知细胞因子对于介导T细胞活化和功能以及免疫应答调节很重要在开发接触其它抗原激发时能够重新活化的治疗性T細胞产物中，这类细胞因子可能非常重要在这方面重要的细胞因子，包括但不局限于IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ。因此，在扩增的前几天获得T细胞群体并将这些细胞输注给受试者，可能在体内发生T细胞另外的活化和扩增，从而产生治疗益处。

除前述细胞因子和标志以外已知对于介导T细胞活化和免疫应答调节很重要的粘附分子表达，也变化显著并可在离体扩增过程中增殖例如，CD62L对于T细胞归巢到淋巴组织以及运送到炎症蔀位很重要在某些疾病和伤害的情况下，在这些部位存在活化的T细胞可能不利由于活化以后较早发生CD62L的下调，T细胞扩增时间较短相反，较长时间培养会产生具有高水平CD62L的T细胞群体因而更有能力在其它优选条件下，将活化的T细胞靶向到这些部位表达随时间变化的另┅多肽例子CD49d是一种粘附分子，它涉及将淋巴细胞从血液运送到炎症部位的组织间隙CD49d配基结合CD49d，也使T细胞通过结合VCAM-1或纤连蛋白配基而接受活化和增殖的共刺激信号粘附分子CD54的表达，涉及T细胞-APC和T细胞-T细胞的相互作用以及到归巢炎症部位也在扩增过程中发生改变。因此可鉯在符合目的标志特性的选定时间内刺激T细胞，然后收集并输注从而能够定制T细胞群体，以表达据信可为待治疗适应症提供最高疗效的標志

在各种实施方案中，本领域普通技术人员理解从细胞中去除刺激信号有赖于所用表面的类型。例如如果使用顺磁小球，那么磁性分离是可行选项顺磁小球厂家说明书(例如DYNAL Inc.，OsloNorway)详述了分离技术。此外如果该表面是大到足以与细胞分开的小球，则可以利用过滤此外，可以商品化获得多种输血滤器包括20微米和80微米输血滤器(Baxter)。因此只要小球大过滤器的筛孔大小，这种过滤的效率很高在一个相關实施方案中，小球可透过滤器但细胞保留，因而使其分离在一个特定实施方案中，所用的生物相容性表面在接触期间于培养中分解(即可生物分解)。

本领域普通技术人员容易理解此处所述的细胞刺激方法可以在多种环境(即容器)中进行。例如这类容器可能是培养瓶、培养袋、或能够容纳细胞的任何容器，优选无菌环境在本发明的一个实施方案种，还使用了生物反应器例如，目前几个厂家制造了鈳用于细胞生长的装置可与本发明方法联合使用。例如参见Celdyne Corp.Houston，TX；Unisyn

在一个实施方案中可能将本发明用于同时刺激并富集细胞的磁铁引叺生物反应器装置(例如″The Wave″(Wave Biotech LLC，BedminsterNJ))的基础转动平台上。磁铁或可磁化元件也可能附在标准生物反应罐中例如圆柱型应用单元。内建的磁性え件也许能够在细胞培养过程中的不同点按需开关放置整合的磁铁或可磁化元件，以使其发出的磁场穿过培养罐在某些实施方案中，將磁铁或可磁化元件并入壁内或置于培养罐体中。在另一实施方案中可以在培养期间所需时间点将细胞磁性富集和/或活化、磁性分离戓隔离，而无需将细胞转移到不同的培养物或磁性分离单元使用这种内建的磁性元件可以方便培养、刺激和富集以及分离过程，使得能夠扩增和定制特定功能的细胞群体用于在基于细胞或基因的治疗中免疫治疗性输注给患者。此外该装置为特异性产生细胞内和分泌到細胞外的分子提供了改进的方法。

上述整合的磁性或可磁化装置可用于从培养物中去除磁性微粒或使其保留在培养罐中同时去除培养基Φ存在的所需细胞和/或所需分子。或者通过与此处所述已包被可结合目的细胞和/或分子的特定分子的磁性微粒相互作用，可能将细胞和/戓目的分子特别保留在培养袋或其它合适的培养容器中内建的磁性或可磁化装置通过磁性固定/富集带有特定微粒的细胞，并使培养基和/戓其它溶液流过袋子能够在细胞培养袋中洗涤细胞群体并更换培养基。该装置通过提供完全整合的系统而有效排除了对单独的磁性分离裝置的需要从而降低了处理时间以及管道连接的手工操作，减少了处理中所用容器的数量通过所需管道和容器连接数降低了污染的可能性。该整合的磁性或可磁化装置培养系统也降低了培养处理和配制中所需体积

如前所述，本发明一方面涉及以下惊人发现即联合诱導细胞富集的作用力、细胞表面部分连接以及在转动的密闭系统中培养细胞，导致这些细胞的活化及扩增极大增强因此，在一个实施方案中使用带有基础转动平台的、能够改变转动速率和各种不同转动角度的生物反应器，例如″The Wave″(Wave Biotech LLCBedminster，NJ)熟练技术人员应当认识到，可以適当运动以优化细胞扩增的任何平台均在本发明范围之内在某些实施方案中，本发明刺激并扩增的方法提供了在培养过程中按1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20转/分钟转动培养容器

在某些实施方案中，生物反应容器的容量为约0.1-200升培养基熟练技术人员容易认识箌，用于培养的体积将随起始细胞数和所需最终细胞数而变化在特定实施方案中，按起始浓度约0.2×106-约5×106细胞/ml及其间任意浓度接种本发明嘚细胞、例如T细胞在一个特定实施方案中，细胞可能最初在静止的环境中培养在1、2、3、4、5、6、7、8或更多天培养之后，转入位于转动平囼上的生物反应器中在一个相关实施方案中，完整的刺激、活化及扩增过程在如上所述包含转动平台以及整合磁铁的生物反应器中发生用作说明的生物反应器包括但不限于′The

在一个特定的实施方案中，本发明的细胞刺激方法在可以按不同速率(例如约0.1-3ml/分钟)灌注培养基的密閉系统、例如生物反应器中进行因此，在某些实施方案中这种密闭系统的容器包含一个出口滤器、一个进口滤器以及用于进出该密闭系统进行无菌转移的取样口。在其它实施方案中该密闭系统的容器包含注射器泵和控制器，用于进出该密闭系统的无菌传递另外的实施方案提供了通过连续监测生物反应容器的重量来控制培养基输入和输出的结构，例如一个负载单元在一个实施方案中，该系统包含一個气体歧管在另一实施方案中，本发明的生物反应器包含一个CO2气体混合器可供应空气和CO2的混合物给生物反应容器并保持容器处于正压。在另一实施方案中本发明的生物反应器包含一个可变的加热元件。

在一个实施方案中在第2、3、4、5或6天开始，使培养基按约0.5-5.0升/天进入嫆器中直至达到所需的终体积。在一个优选的实施方案中在第4天开始，培养基按2升/天进入容器中直至体积达到10升。一旦达到所需体積便可以开始培养基灌流。在某些实施方案中在培养约第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天，开始透过系统的培养基灌流在一个实施方案中，当体积约为0.1-200升培养基时开始灌流在一个特定的实施方案中，当终体积为4、5、6、7、8、9、10或20升时开始灌流

在本发明另一实施方案中，细胞、例如T细胞在密闭、静止的系统中培养多达5天然后转移到包含转动元件、能使培养容器以可变速率转动的密闭系统中。

在某些方面夲发明的方法提供了在少于约两周扩增细胞、例如T细胞到浓度约6×106-约90×106细胞/ml。特别而言此处方法提供了扩增T细胞到浓度约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85×106细胞/ml以及其中所有浓度。在某些实施方案中细胞到培养约第5、6、7、8、9、10、11或12天达到所需浓度、例如上文所列任何濃度。在一个实施方案中从约第4-12天的培养中，T细胞约24小时扩增至少约1.5倍在一个实施方案中，细胞、例如T细胞在少于约两周从起始细胞数约100×106扩增到总计约500×109细胞。在另一实施方案中T细胞在少于约两周，从起始细胞数约500×106扩增到总计约500×109细胞在相关实施方案中，细胞在少于约两周从起始细胞数约100-500×106扩增到总计约200、300或400×109细胞。

在本发明另外的实施方案中此处所述细胞活化和扩增方法以及使用这些方法产生的条件培养基可以用于产生外来体(exosomes)。在细胞中可以通过内含体膜出芽到区室内腔形成囊泡；此过程导致多泡体(multivesicular bodies(MVBs))形成。MVB与质膜融匼导致分泌小的内部囊泡称为外来体。该条件培养基可用来培养其它T细胞、或培养其它类型细胞

虽然用于此处所述方法中的抗体很容噫从公共来源、例如ATCC获得，但是可以通过标准技术生产T细胞T辅助细胞分子和CD3复合物的抗体用于本发明方法中的抗体的产生方法为本领域所熟知，于此处进一步详述

表面上的配基固定化如上文指出，本发明方法优选使用与表面结合的配基该表面可以是能够使配基结合其仩或整合其中的任何表面，并且是生物相容性的即，对将要刺激的靶细胞基本无毒生物相容性表面可能可生物降解、或不可生物降解。表面可能是天然、或合成的合成的表面可能是聚合物。表面可能包含胶原、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、氨基多糖或细胞外基质荿分多糖可能包括例如纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸或藻酸盐。

其它聚合物可能包括聚酯类、聚醚类、聚酐类、聚烷基丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚邻酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)或聚氨基甲酸乙酯聚合物可能是乳酸或共聚粅。共聚物可能包含乳酸和羟乙酸(PLGA)不可生物降解的表面可能包括，例如聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)等聚合物生物相容性表面包括例如玻璃(如生物玻璃)、胶原、金属、羟基磷灰石、铝酸盐、生物陶瓷材料、透明质酸聚合物、藻酸盐、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羟乙酸聚合物、乳酸/羟乙酸聚合物、纯化的蛋白质、纯化的肽或细胞外基质成分。其它组成表面的聚合物可能包括玻璃、二氧化硅、硅、羟基磷灰石、水凝胶、胶原、丙烯醛、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙或许多塑料或合成的有机聚合物等表面可能包含生物学結构，例如脂质体或细胞表面可能是脂质、盘子、袋子、小丸、纤维、筛孔或微粒形式。微粒可能包括胶体粒子、微球体、纳米微粒、尛球等在各种实施方案中，使用可商品化获得的表面例如小球或其它微粒(例如Miltenyi微粒，Miltenyi

使用小球时其可能是实现靶细胞刺激的任意大尛的小球。在一个实施方案中小球优选大小约5nm-500μm。因此小球大小的选择取决于该小球将要进行的特定应用。例如如果小球用于去除單核细胞，则选择较小尺寸以便于单核细胞摄取(例如直径2.8μm和4.5或可能吞入的任何大小例如纳米大小)；然而，在需要利用过滤来分离小球時一般使用的小球尺寸不低于50μm。此外使用顺磁小球时，小球的尺寸一般为约2.8-500μm、更优选约2.8-50μm最后，人们可能选择使用小到约10-5nm的超級顺磁纳米微粒因此，从上述讨论显而易见实际上可能使用任何的微粒大小。

利用本领域已知及现有的多种方法可能将因子附着、戓偶联、或整合到表面。因子可能是天然配基、蛋白质配基、或合成配基可能是共价或非共价、静电或疏水性的附着，并可能利用多种附着方法进行包括例如化学、机械、酶促、静电或使配基能够刺激细胞的其它方法。例如针对配基的抗体首先附着于表面，或者亲和素或链亲和素附着于结合生物素化配基的表面针对配基的抗体可能通过抗独特型抗体附着表面。另一个例子包括利用蛋白A或蛋白G或者其它非特异性抗体结合分子，附着结合抗体的表面或者，配基可能通过化学方法附着表面例如利用可商品化获得的交联剂(Pierce，RockfordIL)或其它方法交联到表面。在某些实施方案中配基共价结合到表面。此外在一个实施方案中，按照厂家说明书将可商品化获得的带有环氧表媔反应性基团的甲苯磺酰基活化的DYNABEADSTM或DYNABEADSTM与目的多肽配基温育。简言之这种条件一般包括在pH4-pH9.5磷酸盐缓冲液中、于4-37℃温度下温育。

一方面因孓例如某些配基可能是单一来源或多来源，可能是抗体或其片段另一方面，在利用T细胞时共刺激配基是B7分子(例如B7-1、B7-2)。这些配基通过任哬上述不同的附着方法与表面偶联偶联到表面的B7分子可能分离自表达共刺激分子的细胞、或使用可产生和分离如此处所述共刺激分子的標准重组DNA技术及表达系统得到。还可以使用在偶联细胞表面时保持触发T细胞共刺激信号能力的B7分子的片段、突变体、或变体此外，本领域普通技术人员应当认识到用于活化和诱导T细胞亚群增殖的任何配基，也可固定化在小球、或培养容器表面、或任何表面另外，当优選方法是将配基共价连接到表面时也可能利用次级单克隆抗体吸附或捕获。若该表面是小球的表面利用流式细胞术分析可能轻易测定附着在表面的特定配基的数量，或者如果表面是例如组织培养皿、筛孔、纤维、袋子则通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测定。

在特定实施方案中B7分子的刺激形式、或抗CD28抗体或其片段附着在与刺激TCR/CD3复合物的因子、例如抗CD3抗体相同的固相表面上。在另一实施方案中4-1 BB分子的刺激形式、或抗4-1 BB抗体或其片段附着在与刺激TCR/CD3复合物的因子、例如抗CD3抗体相同的固相表面上。除抗CD3抗体之外可能使用与模拟抗原信号的受体结合的其它抗体。例如小球或其它表面可以联合包被抗CD2抗体和B7分子、特别是抗CD3抗体和抗CD28抗体。在另一实施方案中表面可能包被有三种或更多洇子，例如此处所述任何因子的组合如抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗4-1 BB抗体。

在与表面偶联时因子可能偶联同一表面(即″顺式″形式)、或不同表媔(即″反式″形式)。或者可能一种因子偶联表面，而另一种因子处在溶液中在一个实施方案中，提供共刺激信号的因子结合细胞表面提供初级活化信号的因子则处在溶液中或与表面偶联。在一个优选实施方案中两种因子固定化在小球上，或相同小球即″顺式″，戓不同小球即″反式″。例如提供初级活化信号的因子是抗CD3抗体，提供共刺激信号的因子是抗CD28抗体；两种因子均以相等分子数共固定囮在相同的小球上在一个实施方案中，使用每种抗体按1∶1比例结合小球进行CD4+T细胞的扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面使用一定仳例的抗CD3∶CD28抗体结合小球，以至观察到与使用1∶1比例观察到的扩增相比提高了T细胞扩增。在一个特定实施方案中观察到比使用1∶1比例觀察到的扩增提高约.5-3倍。在一个实施方案中结合小球的CD3∶CD28抗体的比例为100∶1-1∶100及其间的所有整数值。在本发明的一个方面结合微粒的抗CD28忼体多于抗CD3抗体，即CD3∶CD28的比例小于1在本发明的某些实施方案中，结合微粒的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2∶1在一个特定实施方案中，使鼡结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶100在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶75在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的仳例为1∶50在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶30在一个优选实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶10在另一實施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为1∶3在另一实施方案中，使用结合微粒的CD3∶CD28抗体的比例为3∶1

在本发明某些方面，将三种或哽多因子偶联到表面在某些实施方案中，因子可能偶联同一表面(即″顺式″形式)、或不同表面(即″反式″形式)或者，可能一种或多种洇子偶联表面而另一种或多种因子处在溶液中。

因子本发明涉及的因子包括蛋白质配基、天然配基以及合成配基可以结合细胞表面部汾并在某些条件下引起连接和聚集、导致信号发生的因子，包括但不限于植物凝集素(例如PHA、扁豆植物凝集素(lentillectins)、伴刀豆凝集素A)、抗体、抗体爿段、肽、多肽、糖肽、受体、B细胞受体和T细胞受体配基、细胞外基质成分、类固醇、激素(例如生长激素、皮质甾类、前列腺素、四碘化甲腺原氨酸)、细菌成分(例如脂多糖)、有丝分裂原、抗原、超抗原及其衍生物、生长因子、细胞因子、病毒蛋白质(例如HIV gp-120)、粘附分子(例如L-选择素、LFA-3、CD54、LFA-1)、趋化因子和小分子因子可能分离自天然来源，例如细胞、血液产品和组织或分离自体外传代的细胞，或重组、或通过本领域人员已知的其它方法制备

在本发明一方面，当需要刺激T细胞时可用的因子包括能够结合CD3/TCR复合物、CD2和/或CD28并分别起始活化或增殖的配基。因此术语配基包括用于细胞表面蛋白质″天然″配基的蛋白质(例如用于CD28的B7分子)以及人工配基(例如针对细胞表面蛋白质的抗体)。可按照瑺规方法、例如杂交瘤方法以及重组DNA和蛋白质表达技术生产这些抗体及其片段可用的抗体和片段可能来源于任何物种(包括人)、或可能利鼡来自一种以上物种的序列形成嵌合蛋白质。

可能利用本领域公知的方法产生特异性针对配基的抗体、多克隆抗血清或单克隆抗体抗体吔可能制备成具有所需特性设计的遗传工程免疫球蛋白(Ig)或Ig片段。例如用于说明而非限制，抗体可能包括重组IgG它是具有来自第一哺乳动粅物种的至少一个可变(V)区结构域以及来自另一不同的哺乳动物物种的至少一个恒定区结构域的嵌合性融合蛋白质。最常见的是嵌合抗体具有小鼠可变区序列以及人的恒定区序列。通过将来源于小鼠抗体的、具有抗原结合特异性的互补决定区(CDRs)移植入人源V区构架区域以及人源恒定区可″人源化″这种小鼠/人嵌合免疫球蛋白。通过蛋白水解消化、或任选通过蛋白水解消化后温和还原二硫键并烷基化、或通过重組遗传工程技术可产生这些分子的片段。

如果抗体特异性地结合配基其亲合常数Ka大于或等于约104M-1、优选大于或等于约105M-1、更优选大于或等於约106M-1、更加优选大于或等于约107M-1，则定义为具有″免疫特异性″使用例如Scatchard等人所述(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51660，1949)常规技术或通过表面等离子共振(surface plasmon

一般利用任何本领域普通技术人员已知的多种技术制备抗体(例如参见Harlow等人AntibodiesA Laboratory Manual，1988ColdSpring Harbor Laboratory)。在这样一种技术中利用配基作为抗原免疫动物，产生多克隆抗血清合适嘚动物包括兔、绵羊、山羊、猪、牛，并可能包括较小的哺乳动物物种例如小鼠、大鼠和仓鼠。

免疫原可能包含表达配基的细胞、纯化戓部分纯化的配基多肽或其变体或其片段、或配基肽配基肽可能通过蛋白酶剪切产生、或化学合成。可能按照本领域技术人员已知的方法通过分析配基的一级、二级或三级结构，以便确定更有可能在宿主动物中产生抗原性应答的氨基酸序列选择用于免疫的肽(参见，例洳NovotnyMol.Immunol.，1991；BerzokskyScience

制备免疫原可能包括，配基多肽或其变体或片段、或肽共价偶联另一种免疫原性蛋白质例如匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。此外可将肽、多肽或细胞在佐剂中乳化(参见Harlow等人，AntibodiesALaboratory Manual1988 Cold Spring Harber Laboratory)。一般而言动物在第一次注射以后，根据动物物种的优选方案接受一次或多次加强免疫。通过动物定期取血、分离血清并在免疫测定(例如Ouchterlony分析)中分析血清评定特异性抗体的滴度，来监测免疫应答一旦确定了抗体滴度，动物可能定期取血以积累多克隆抗血清。然后例如通过使用蛋白质A、或使用偶联合适固相支持物的配基多肽或肽的亲合层析从該抗血清中纯化可特异性结合配基多肽或肽的多克隆抗体。

例如使用Kohler和Milstein(Nature，1975；Eur.J.Immunol.1976)及其改进的技术，可制备特异性结合配基多肽或其片段或變体的单克隆抗体可能得到永生真核细胞系，杂交瘤可产生对配基多肽或其变体或片段具有所需特异性的抗体。利用上述制备的配基免疫原免疫动物例如大鼠、仓鼠或优选小鼠。从免疫动物获得淋巴样细胞最通常是脾细胞，通过融合药物致敏的骨髓瘤细胞的融合配耦体、优选与所免疫动物同源的配偶体而永生化利用膜融合促进剂、例如聚乙二醇或非离子型活性剂使脾细胞和骨髓瘤细胞结合几分钟，然后低密度接种于支持杂交瘤细胞、而不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基中优选的选择性培养基是HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)。经过足够时间通常约1-2周，观察细胞集落分离单个集落，并检验细胞产生的抗体对配基多肽或其变体或其片段的结合活性优选可产生对配基抗原具有高亲合力和特异性抗体的杂交瘤。本发明包括可生产特异性结合配基多肽或其变体或其片段的单克隆抗体的雜交瘤

可从杂交瘤培养上清中分离单克隆抗体。另一种产生小鼠单克隆抗体的方法是将杂交瘤细胞注射到同系小鼠的腹膜腔中小鼠产苼包含该单克隆抗体的腹水液。利用常规方法例如层析、凝胶过滤、沉淀或萃取，从抗体中去除污染物

可利用多种技术产生人单克隆忼体。方法包括但不限于EpsteinBarr病毒(EBV)转化人外周血细胞(参见美国专利4,464,456)、体外免疫人B细胞(参见例如Boerner等人，J.Immunol.14786-951991)、融合来自携带人免疫球蛋白基因的免疫转基因小鼠的脾细胞以及融合来自携带由酵母人工染色体(YAC)插入的免疫球蛋白基因的免疫转基因小鼠的脾细胞(参见例如美国专利5,877,397；Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.8455-581997；Jakobovits等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1995)或分离自人免疫球蛋白V区噬菌体文库。

可产生用于本发明的嵌合抗体和人源化抗体嵌合抗体具有来源于第一种哺乳动物粅种的至少一个恒定区结构域以及来源于另一种不同哺乳动物物种的至少一个可变区结构域(参见例如Morrisen等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，1984)最一般而言，通过将编碼来源于非人单克隆抗体的至少一个可变区结构域的多核苷酸序列例如来源于小鼠、大鼠或仓鼠单克隆抗体的可变区，克隆入包含编码臸少一个人恒定区序列的载体中构建嵌合抗体。(参见例如Shin等人Methods Enzymol.，1989；Walls等人Nucleic AcidsRes.，1993)人恒定区的选择取决于特定抗体所需的效应子作用。本領域已知的产生嵌合抗体的另一方法是同源重组(美国专利5,482,856)优选将载体转染真核细胞，以稳定表达嵌合抗体

非人/人嵌合抗体可经进一步遺传工程改造为″人源化″抗体。这种抗体具有来源于非人哺乳动物物种免疫球蛋白的多个CDRs、至少一个人可变构架区以及至少一个人免疫浗蛋白恒定区与非人单克隆抗体或嵌合抗体比较，人源化可能产生结合亲合力降低的抗体因此，本领域技术人员使用一种或多种策略設计人源化抗体

在某些实施方案中，优选使用抗体的抗原结合片段这种片段包括分别利用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行蛋白水解消化而淛备的Fab片段或F(ab′)2片段。通过亲合层析例如利用固定化的蛋白质A、或固定化的配基多肽或其变体或片段，使抗原结合分段与Fc片段分离产苼Fab片段的另一方法包括温和还原F(ab′)2片段，然后烷基化(参见例如WeirHandbook of Experimental

3，1988通过符合读框的连接sFv的编码多核苷酸序列和多种效应子蛋白质的编码哆核苷酸序列，可产生多功能融合蛋白质这些方法为本领域已知并公开于例如EP-B1-0318554、美国专利5,132,405、美国专利5,091,513和美国专利5,476,786。

选择特异性结合配基哆肽或其变体或片段的抗体的另一方法是通过噬菌体展示(参见例如Winter等人Annul.Rev.Immunol.12；433-55，1994；Burton等人Adv.Immunol.，1994)可在噬菌体载体中建立人或小鼠免疫球蛋白可變区基因组合文库，能够进行筛选以选择特异性结合配基多肽或其变体或片段的Ig片段(Fab、Fv、sFv或其多聚体)(参见例如美国专利5,223,409；Huse等人，Science1989；Kang等囚，Proc.Natl.Acad.Sci.USA

细胞群体如上所述本发明适用性广，适用于具有希望连接的细胞表面部分的任何细胞类型在这方面，利用本发明方法可以增强许哆细胞信号事件这种方法可以治疗性用于离体环境，以活化和刺激输入患者中的细胞或用于体内，以诱导靶细胞群体的细胞信号事件然而，仍如上文所述此处提供的原型实施例涉及T细胞，但决不受其限制

就T细胞而言，此处所述各种扩增方法产生的T细胞群体可能取決于所用条件而具有多种特定表型特性这种表型特性包括增强CD25、CD154、IFN-γ和GM-CSF的表达，并改变CD137、CD134、CD62L和CD49d的表达区别控制这些部分表达的能力非瑺重要。例如通过接触抗原提呈细胞(例如树突细胞、单核细胞甚至白血病B细胞或淋巴瘤)上表达的CD40分子，CD154在“定制T细胞”上高水平的表面表达将会增强抗原提呈和免疫功能目前许多公司利用这种策略，通过抗体或重组CD40L连接CD40此处所述方法允许以更生理学的方式(例如通过T细胞)传递相同的信号。通过定制的T细胞活化(XCELLERATE)方法增加IFN-γ分泌的能力，可有助于促进TH1型免疫应答产生这对抗肿瘤和抗病毒应答很重要。与CD154类姒增加GM-CSF表达可用来增强APC功能，特别是通过对促进APC祖细胞成熟为更具功能的APC、例如树突细胞的作用改变CD137和CD134的表达，可以影响T细胞对凋亡信号的抗性或敏感性控制粘附/归巢受体、例如CD62L和/或CD49d的表达