：具有增强我是最强的ADCcc功能的抗體的制作方法
具有增强我是最强的ADCCC功能的抗体发明领域
本发明关注具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体及其制 备方法
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种细胞介导的反应，其中表达Fc 受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞嗜中性细胞，和巨噬细 胞)識别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞溶胞已知在人IgG类的抗体中，tgGl 亚类具有最高我是最强的ADCCC活性和CDC活性而且当前临床肿瘤学实践Φ的大多数人源化抗 体，包括商品化的HERCEPTIN
(曲妥单抗)和RITUXAN (利妥昔单抗)(它们需要 高效应器功能来实现它们的效果)是人IgGl亚类的抗体
为了增强治疗性忼体的效力，常常希望在效应器功能方面修饰抗体例如为 了增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性 (CDC)。这在腫瘤学领域会是特别有益的其中治疗性单克隆抗体结合肿瘤细胞上的特 定抗原并诱导免疫应答，导致对肿瘤细胞的破坏通过增强^G与携帶1 受体的杀伤细 胞的相互作用，能使得这些治疗性抗体更有效力
效应器功能，诸如ADCC的增强可以通过多种手段来实现包括在抗体的Fc区 中引入一处或多处氨基酸替代。或者/另外可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，由此 容许在此区域中形成链间二硫键如此生成的同二聚体抗体鈳具有改良的内在化能力和 /或升高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caran et al.J.Exp Med. 176
另一种增强抗体(包括:tgG类的抗体)的效应器功能的办法是改造抗体Fc区的 糖基化样式。tgG分子含有N-连接的寡糖其共价附着于Fc区中每个CH2结构域的保 守ASM97。在血清:tgG的份区中找到的寡糖大多是复匼类型的双触角聚糖已经报告 了多种抗体糖型对抗体效应器功能(包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))具有
具有选定糖型的抗体已经通过哆种手段生成，包括使用糖基化途径抑制剂具 有缺失的或降低的糖基化途径中特定酶活性的突变细胞系，糖基化途径中的基因表达 增强戓敲除的改造细胞及用糖苷酶和糖基转移酶体外再塑。Rothman et al.1989 ； Molecular Immunology 26 外周血单个核细胞细胞作为效应器。单糖组成和寡糖序型分析显示了与CHO生成嘚:tgGl
的高岩藻糖(Fuc)含量相比复合型寡糖的低Fuc含量在YB2/0生成的:tgGl中是特征性 的。Kandaetal.2006 ； Glvcobiologv 17, 104-118记载了携带无岩藻糖基复合物，无岩 901-8使用岩藻糖基转移酶特异性短干扰RNA(SiRNA)使所表达的抗体的效 应器功能最大化
判断，看来有至少两种具有不同清除特征的不同抗体群清除更快速的:tgG群大概是携 带Man7，89糖型的抗体。
一方面本发明关注一种缺乏GIcNAC转移酶I活性的哺乳动物细胞，其被改造 成表达抗体或其片段或免疫粘附素或其片段。在一个具体的实施方案中所述哺乳动 物细胞还具有增强的α-1，2-甘露糖苷酶(在本文中也称作α-甘露糖苷酶I)活性
另一方面，本发明关注一种其中GIcNAC轉移酶I活性通过RNAi敲低被降低的 哺乳动物细胞其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段在一个具体的 实施方案中，所述哺乳动物细胞还具有增强的α-12-甘露糖苷酶活性。
另一方面本发明关注一种其中GIcNAC转移酶I活性通过RNAi敲低被降低 且其还可具有增强的α-1，2-甘露糖苷酶活性的哺乳动物细胞这足以产生包含5%或 更多，或10%或更多或20%或更多，或25%或更多或30%或更多，或35%或更多 Man5, Man6聚糖的碳水化合物结构其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或 其片段其中所述片段包含至少一个糖基化位点。
另一方面本发明关注一种其中GlcNAc转移酶I活性通过高尔基UDP-GlcNAc 转运蛋白RNAi敲低被降低且其还可具有增强的α-1，2-甘露糖苷酶活性的哺乳动物细 胞其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段其中所述片段包含至少一 个糖基化位点。
又一方面本发明关注一种其中GlcNAc转移酶I活性通过高尔基UDP-GlcNAc 转运蛋白RNAi敲低被降低且GIcNAC转移酶I通过RNAi也被敲低的哺乳动物细胞，其 被改造成表达抗体或其片段或免疫粘附素或其片段，其中the片段包含至少一个糖基化 位点7
还有一方媔，本发明关注一种用于制备主要携带Man5聚糖的抗 体或其片段或 免疫粘附素或其片段的方法，包括在使得所述抗体或其片段或免疫粘附素或其片段生 成的条件下培养依照权利要求2或权利要求22的哺乳动物细胞系。又一方面本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构Φ具有受控量的 Man5聚糖的抗体，免疫粘附素或其片段的方法，包括在由于RNAi敲低而具有降低的
GlcNAc转移酶I活性的哺乳动物细胞系中表达编码所述忼体或抗体片段的核酸仍有一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带 Man5聚糖的抗体免疫粘附素，或其片段嘚方法包括在存在α _1，2-甘露糖苷酶下培 养缺乏GIcNAC转移酶I活性的哺乳动物细胞系该细胞系被改造成表达所述抗体，免疫
粘附素或其片段，或者使所表达的产物接触此类α-12-甘露糖苷酶，其中Man7 8，9聚糖被转变成Man56聚糖。仍有一方面本发明关注一种用于制备携带5%或更多，或10%戓更多或 20%或更多，或25%或更多或30%或更多，或35%或更多Man5聚糖的抗体或其片 段或免疫粘附素或其片段的方法，包括在使得所述抗体或其片段或免疫粘附素或其
片段生成的条件下培养依照权利要求2或权利要求14的哺乳动物细胞系，其中所述片段 包含至少一个糖基化位点本发明還关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5聚糖的抗 体，免疫粘附素或其片段的方法，包括在存在α-12-甘露糖苷酶下培养甴于RNAi 敲低而具有降低的GIcNAC转移酶I活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述
抗体免疫粘附素，或其片段或者使所表达的产物接觸此类α-1，2-甘露糖苷酶其 中Man7，89聚糖被转变成Man5，6聚糖另一方面，本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5 聚糖的忼体免疫粘附素，或其片段的方法包括在存在毒性凝集素下培养哺乳动物细 胞系以选择出具有降低的GIcNAC转移酶I活性的克隆，改造一个或哆个所述具有降低的
GIcNAC转移酶I活性的克隆来在存在α-12-甘露糖苷酶下表达所述抗体，免疫粘附 素或其片段，或者使所表达产物接触α-12-甘露糖苷酶，其中Man78，9聚糖被 转变成Man5聚糖其中所述片段包含至少一个糖基化位点。在一个具体的实施方案中 所述甘露糖苷酶是用于重组苼产的细胞中内源的。还有一方面本发明关注一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带
Man5聚糖的抗体，免疫粘附素或其片段的方法，包括在存在α _12-甘露糖苷酶下 培养缺乏UDP-GlcNAc转运蛋白活性的哺乳动物细胞系，该细胞系被改造成表达所述抗 体免疫粘附素，或其片段或者使所表达的产物接触此类α-1，2-甘露糖苷酶其中 Man7, 8，9聚糖被转变成Man5聚糖其中所述片段包含至少一个糖基化位点。在一个
具体的实施方案中所述甘露糖苷酶是用于重组生产的细胞中内源的。在所有方面中所述哺乳动物细胞系可以是例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。在所有方面中本发明的细胞系和方法可用于生产任何抗体，包括但不限于 诊断上或治疗上感兴趣的抗体诸如结合一种或多种下述抗原的抗体CD3，CD4 CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40, EGF 受体(EGFR，HERl,
neuropilin及受体导蛋白及受体，slit及受体sema及受体，脑信号蛋白及受体robo
及受体，和Ml 所述抗体和抗体片段可以是嵌合的或人源化的，洏且具体包括嵌合的和人 源化的抗CD20抗体其中，在一个具体的实施方案中所述抗体是rituximab或 ocrelizumab。在另一个实施方案中所述人源化抗体是HER2，抗HER1抗VEGF或抗 IgE 抗体，包括但不限于 trastuzumab pertuzumab, bevacizumab，
ranibizumab禾口 omalizumab,以及此类抗体的片段，变体和衍生物抗体片段包括例如互补决定区(CDR)片段，线性抗体单链抗体汾子，微型抗 体双抗体，自抗体片段形成的多特异性抗体和含有免疫球蛋白至少一部分的多肽， 该部分足以赋予多肽以特异性抗原结匼前提是它们是糖基化的。附图简述
置(圆括号中)每一种SiRNA探针序列标有下划线(a)。接近BamHI位点的标有下划 线的序列与GnT-ImRNA序列互补两种标有下劃线的序列彼此互补，导致形成发夹环 SiRNA0图5对来自各SiRNA探针和带FLAG 标签的GnT-I构建物的共转染的溶胞物 的Western印迹分析。五种siRNA表达构建物以及空载体与帶FLAG 标签的GnT-I构建 物瞬时共转染使用抗FLAG
抗体(Sigma MO)通过Western印迹分析含有等量细胞蛋 白质的细胞溶胞物。图6A生成ocrelizumab的细胞系用siRNA表达质粒瞬时转染。转染後第1
2和5天收集来自每种样品条件的细胞团粒，然后分离mRNA供TaqMan分析用。对照 的GnT-I mRNA表达水平设为100 %图6B。来自每份用所示RNAi载体转染的样品的转染後第5天的Man5水平图7。为一项14天的实验杂乱和RNAi 13载体瞬时转染入ocrelizumab生成细
胞系。使用CE-聚糖测定所示培养期间收集的HCCF的Man5水平误差棒代表来自两 佽运行的标准偏差。图8ACHO α -甘露糖苷酶I的cDNA序列。图8BCHO和小鼠α-甘露糖苷酶I之间的氨基酸序列比对。图8CSV40GS.CMV.Manl.RNAil3 表达质粒的构造。图9A通过TAQMAN 测定法測定的稳定克隆中的相对GnT-I mRNA水平。
对照代表未转染基线中的GnT-I水平图9B。14天的生产运行结束时稳定克隆的Man5水平通过CE-聚糖分析测定 Man5%。图10A培养期间各天的Man5水平。通过CE-聚糖测定法测定Man5水平
而误差棒代表标准偏差。图10B22天培养后Man5水平的比较。测试基本培养基中的四种不同摩尔渗 透壓浓度(300330，360400m0sm)。通过CE-聚糖测定法测定Man5水平图10C。总共14天的培养的不同天添加MnCl2下的Man5水平通过CE-聚 糖测定法测定Man5水平。图IOD不同细胞培养条件丅GnT-I敲低克隆6D的Man5水平(CE-聚糖测定
法)。对照代表标准生产培养基高osmo代表基本培养基中的摩尔渗透压浓度升高至 400m0sm。无Mn代表缺乏锰的标准生产培养基图11。 抗体对Fc Y受体IIIa-Vl58的结合空心圆形代表HERCEPTIN (trastuzumab)，空心正方形代表RITUXAN (rituximab)空心三角形代表具有5% (rituximab)，空心三角形代表具有5%
Man5(7-9%无岩藻糖基聚糖)的抗受体抗体空心菱形代表具有16% Man5(14.6%无岩 藻糖基聚糖)的抗受体抗体，而实心圆形代表具有62%Man5(ll%无岩藻糖基聚糖)的 抗受体抗体发明详述I.定义“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中 页表 3 总结了造血细胞上的 FcR
表达为了评估目的分子我是最强的ADCCC活性，可进行体外ADCC测定法诸如美国专利 No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核 细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞或者/另外，可在体内评估目的分孓我是最强的ADCCC 活性例如在动物模型中，诸如Clynes etal.PNAS (USA) 95 652-656(1998)中所披露
的。“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞优选的 是，該细胞至少表达Fc Y RIII并行使ADCC效应器功能介导ADCC的人白细胞的例子 包括外周血单个核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜 中性粒細胞优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离例如如本文所
述从血液或PBMC分离。术语“Fe受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体優选的FcR是 天然序列人FcR。此外优选的FcR是结合IgG抗体的FcR( Y受体)，包括FcyRIFc Y RII和Fc Y RIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式Fc Y RII受 体包括Fc Y RIIA ( “活囮受体”)和Fc Y RIIB (
“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序 列区别主要在于其胞质结构域。活化受体Fc Y RIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基 于酪氨酸的活化基序(ITAM)抑制受体Fc Y RIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于 酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述DaSron, Annu.Rev.Immunol.15 203-234 (1997))。 FcR 的综述参见 Ravetch and
转移给胎儿(Guyer etal.J.Immunol.l 17 587(1976) ； Kim etal.，J.Immunol.24 249(1994))并介导较慢的異化，和如此较长的半衰期“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补 体激活途径是由补体系统第一组分(Clq)結合与关联抗原复合的分子(例如抗体)起始
的为了评估补体激活，可进行CDC测定法例如如Gazzano-Santoro etal.，J.Immunol. Methods 202 163(1996)中所记载的“天 然抗体”指通常由两条相同嘚轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约 150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接而二硫键
的数目在不同免疫球蛋皛同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链 内二硫键每条重链在一端具有一个可变域(Vh)，接着是多个恒定域每条轻鏈在一 端具有一个可变域(VJ，而另一端是一个恒定域轻链的恒定域与重链的第一恒定域排 列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列茬一起认为特定的氨基酸残基在轻链
与重链可变域之间形成界面。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于烸种特 定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情然而，变异性并非均勻分布于抗体的整 个可变域它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度 保守的部分称作框架区(FR)天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多 Institutes of Health, Bethesda,
MD. (1991))恒定域不直接参与抗體与抗原的结合，但展现出多种效应器功 能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责忼原结合的氨基酸残基高变区 一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基 24-34 (Li), 50-56
“框架区”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。术语“框架区”指在更加趋异的CDR区间存在的公认的抗体可变区部分此 类框架区通常指框架1至4(FR1，FR2FR3，和FR4)而且在三维空间中为支持在重链 或轻链抗体可变区中找到的三个CDR提供支架，使得CDR能形成抗原结合表面根据其重链恒定域氨基酸序列，抗体可归入不同的类抗体分成五大类IgA， IgD,
IgE, IgG和IgM其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGlIgG2， IgG3IgG4，IgA和 IgA2。将与不同类的免疫球疍白对应的重链恒定域分别称作α，δ，εγ和μ。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入 两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。术语“单克隆抗体”用于指由单一克隆合成的抗体分子修饰语“单克隆”
指示抗体从基夲上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成 抗体如此，单克隆抗体可以通过首次由Kohler and MilsteinNature 256 495(1975)； Eur.J.Immunol.6 511 (1976)记载的杂交瘤方法，通过重组DNA技术来制备或者也可
以自噬菌体或其它抗体文库分离。术语“多克隆抗体”用于指由一群B细胞合成的一群抗体分子“抗体爿段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合域或可变域抗体片 段的例子包括但不限于Fab，Fab'F(ab' )2，scFv, (scFv)2, dAb和互补决定区 (CDR)片段，线性抗体单鏈抗体分子，微抗体双抗体，自抗体片段形成的多特异性
抗体及一般而言至少含有免疫球蛋白的足以赋予多肽以特异性抗原结合的一蔀分的多 肽。本发明的范围内具体有双特异性抗体片段抗体是在Fc区中有糖基化的糖蛋白。如此例如，IgG免疫球蛋白的Fc区是 包含链间二硫鍵合的铰链区在天冬氨酸297(Asn-297)处携带N_连接的寡糖的糖基化 CH2域，和非共价配对的CH3域的同二聚体糖基化在Fc Y RL Fc Y RII, Fc Y
RIII, 和Clq介导的效应器机制中发挥重要作用。如此本发明的抗体片段必然包括糖基化Fc 区和抗原结合区。术语“双特异性抗体”和“双特异性抗体片段”在本文中用于指对至少两种靶 物具有结合特异性的抗体或抗体片段如果需要，可以通过多效价来组合多特异性以 生成对它们的每一种靶物拥有超过一个结合位点嘚多价双特异性抗体。例如通过经螺
旋-转角-螺旋基序二聚化两个scFv融合物，(scFv) r铰链-螺旋-转角-螺旋-(scFv) 2 生成了四价双特异性微型抗体(Miiller et al.，FEBS Lett.432 (1-2) 45-9 (1998))所谓 的“双-二-微型抗体”对它的每一种靶抗原拥有两个结合位点。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段称为“Fab”片段，各自
具囿一个抗原结合位点及一个剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力 胃蛋白酶处理产生一个F(ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点苴仍能够交联抗原"Fv"是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密 非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域嘚二聚体组成。正是在这种构造中各 可变域的三个高变区相互作用而在Vh-V^
二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个 高变区共同赋予抗體以抗原结合特异性然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力只是亲和力低于唍整结合位
点οFab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CHl)。Fab'片段与Fab片 段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基包括來自抗体铰链区的 一个或多个半胱氨酸。Fab' -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离 硫醇基的Fab'的称谓F(ab' )2抗体片段最初是作为在Fab'爿段之间有铰链半胱氨酸
的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗體的“轻链”可归入 两种截然不同的型中的一种称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和^结构域其中这些结 构域存在于一条多肽链中。优选的是Fv多肽在Vh和^结构域之间还包含多肽
接头，使得scFv能够形成抗原结合期望的结构关于scFv的综述参见PKickthun，
术语“雙抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段该片段在同一条 多肽链(Vh-VJ中包含相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(VJ。通过使用过短的 接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对迫使这些结构域与另一条链的互补结 构域配对，从而产生两个抗原结合位点双抗体更完整嘚记载于例如EP 404,097 ； WO 93/11161 ； Hollinger
etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 93)非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球 蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上囚源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的 高变区残基用具有期望特异性，亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠大鼠， 兔或非人灵長类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白在有些情况中，将人免疫球蛋白
的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在 供体抗体中没有找到的残基进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言 人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上整个如下的可变域其中所有或基本上所 Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2
593-596(1992)“裸抗体”或“裸露的抗体”指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块或放射 性标记物的抗体(如本文中所定义的)。“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗 体其天然环境的污染性荿分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶 激素，和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质在优选的实施方案中，将忼体纯化至
根据非还原性SDS-PAGECD-SDS,或Bioanalyzer的测定，抗体重量超过95%既然 抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体 然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”例如受体， 配体或酶)的结合域与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子在结构 上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和結合位点(抗原结合位点)(即是“异源” 的)具有期望结合特异性的粘附素氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫
粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得诸如IgGl，IgG2IgG3 或IgG4亚型，IgAIgE, IgD或IgM。关于免疫粘附素配体结合域和受体结合域的更 多详情参见例洳美国专利No.5,116,964 ； 5,714,147 ；及6,406,604，通过述及将明确其公
开内容收入本文II.详细说明本发明提供一种通过操纵生成抗体或抗体样分子的重组哺乳动物宿主細胞的糖 基化机械在哺乳动物宿主细胞中制备主要携带Man5聚糖但具有降低量的Man7，ManS, 和Man9的的抗体和抗体样分子诸如Fc融合蛋白(免疫粘附素)的方法。用于重组牛产抗体的一般方法本文中的抗体和其它重组蛋白可通过重组DNA技术的公知技术来生产如此，
在上文具体鉴定的抗体之外熟練从业人员能生成针对感兴趣抗原的抗体，例如使用下 文所述技术
依照本发明生产的抗体针对感兴趣抗原。优选的是所述抗原是生物學重 要多肽，而且给患有疾病或病症的哺乳动物施用所述抗体能在该哺乳动物中产生治 疗性好处然而，也涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤楿关糖脂抗原；参见美国专利 No.5,091,178)的抗体若抗原是多肽，则它可以是跨膜分子(例如受体)或配体(诸如 生长因子)本发明所涵盖的抗体的例示性汾子靶物包括CD蛋白，诸如CD3CD4，
或本文所述任何其它抗原上文所列抗体所针对的抗原明确包括在本发明范围内。为了重组生产抗体可以汾离编码抗体的核酸，并插入可复制载体中用于进 一步克隆(DNA扩增)或表达。在另一个实施方案中可以通过同源重组来生产抗体， 例如如媄国专利No.5,204,244中所记载的通过述及明确收入本文。编码单克隆抗体的 DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链嘚基因特
异性结合的寡核苷酸探针)可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种 或多种信号序列复制起点，一种或多种标誌基因增强子元件，启动子和转录终 止序列，例如如1996年7月9日公告的美国专利No.5,534,615中所记载的通过述及明 确收入本文。本发明的抗体必然昰糖基化的且如此适合于克隆或表达编码抗体链或其它抗
体样分子的DNA的宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞。哺乳动物宿主细胞得到很大关 紸而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CVl系(COS-7ATCC CRL 1651)；人胚肾 系(293或为了茬悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等J.Gen Virol.，36 51) ； TRI 细胞(Mather
等Annals N.Y.Acad.Sci.，383 44-68(1982) ； MRC5 细胞；FS4 细胞；和人肝瘤系(Hep G2)将宿主细胞用用于抗体生产的表达或克隆载体转化，并在为了诱导启动子选 择转化子，或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养可以在多种培养基中培养哺乳动粅宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏 FlO
长因子)盐(诸如氯化钠，钙镁和磷酸盐)，缓冲剂(诸如HEPES)核苷酸(诸如 腺苷和胸苷)，抗生素(诸如Gentamycin 药物)痕量元素(定义为通常以微摩尔范围 的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等效能源还可 以以本领域技术人员知道的适 宜浓度包含任何其咜必需补充物。培养条件诸如温度，pH等就是那些先前为表达而
选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言会是显而易见的可以使用例如羟磷灰石层析，离子交换层析凝胶电泳，透析和亲和层析来纯 化由细胞制备的抗体组合物主要的纯化步骤是亲和层析。蛋白A莋为亲和配体的适宜 性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型蛋白A可用于纯化基于人 Y 1,人 Y 2或人 重链的抗体(Lindmark 等，1983J.Immunol.Meth.62:
1-13) 蛋白 G推荐鼡于所有小鼠同种型和人Y 3 (Guss等，1986EMBO J.5 )。亲和配体 所附着的基质最常用的是琼脂糖但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔 径玻璃戓聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间对于 包含Ch3结构域的抗体而言，可使用BAKERBOND ABX 树脂(J.T.BakerPhillipsburg,
NJ)进行纯化。根据待回收嘚抗体也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上 的分级分离乙醇沉淀，反相HPLC硅土上的层析，肝素SEPHAROSE 上的层析阴 离子或阳离孓交换树脂上的层析，层析聚焦SDS-PAGE，疏水相互作用层析和硫酸 铵沉淀。在任何初步的纯化步骤后包含目的抗体和污染物的混合物可以進行别的纯化
步骤以实现期望的纯度水平。人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基这些非人氨基酸残基常常稱作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域人源化可基本上 遵循 Winter 及其同事的方法进行(Jones 等，Nature321 522-525(1986) ； Riechmann 等，Nature332 323-327(1988) ； Verhoeyen
等，Science239 88))， 即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列因此，此类“人源化”抗体是嵌 合抗体(美国专利4,816,567)其中本质上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列 替玳。在实践中人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮
齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。用于制备人源化抗體的人可变域的选择包括轻链和重链，对于降低抗原性非 常重要依照所谓的“最适”(best-fit)法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可 变域序列的整个文库进行筛选然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体 的人FR(Sims等，J.Immunol.151:))。另一种方法使用由特定轻链或重
链亚组嘚所有人抗体的共有序列衍生的特定框架同一框架可用于数种不同的人源化抗 体(Carter 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89: ) ； Presta 等，J.Immunol.1 51 ))。更为重要的是抗体在人源化后保持對抗原的高亲和力及其它有利的生物学特 性。为了实现这一目的依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型
分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体三维免疫球蛋白模型 通常是可获得的，且为本领域技术人员所熟悉还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋 白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫 球蛋白序列行使功能中嘚可能作用即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残 基。这样可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗體特征诸
如对靶抗原的亲和力提高。通常CDR残基直接且最实质性地涉及对抗原结合的影响。或者现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋皛生成的情况下能够在免疫时生成 人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如已经描述了嵌合和种系突变小鼠 中抗体重链连接区(JH)基因嘚纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突 合两种抗原(即双特异性抗体BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的
忼体诸如三特异性抗体。用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的全长双特异性抗体的传统生 产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的囲表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein 等Nature，305 537-539(1983)) 由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些 杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜茬混合物其中只有一
种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低类似的规程披露于WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J., 10 91) 依照W096/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面以将 从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的堺面包含抗体恒定域的至少
部分CH3结构域在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大 侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替換通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸 或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“涳 腔”这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体例洳，可以将异源偶联物中
的一种抗体与亲合素偶联而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如 将免疫系统细胞靶向不想偠的细胞(美国专利No.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360, WO 92/200373及EP 03089)。异源偶联抗体可以使用任何方便的交联方 法来制备合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利
No.4,676,980涵盖具有超过两个效价的抗体。例如可制备三特异性抗体。Tuttet alJ.Immunol.147 60(1991)免疫粘附素s最简单且最直接的免疫粘附素设计将粘附素的结合结构域(例如受体的胞外结 构域(ECD))与免疫球蛋白重链的铰链和Fc区组合在一起。通常在制备本发明的免疫 粘附素时，将編码粘附素结合结构域的核酸融合在编码免疫球蛋白恒定域序列N-末端的
核酸的C-末端然而N-末端融化也是可能的。通常在此类融合物中，所编码的嵌合多肽将至少保留有功能活性的免疫球蛋 白重链恒定区铰链CH2和CH3结构域。还可以对恒定域Fc部分的C-末端进行融合 或者紧挨着重鏈ChI或轻链对应区的N-末端进行。进行融合的精确位点不是至关重要 的；具体位点是众所周知的而且可以进行选择以优化免疫粘附素的生物學活性，分泌
或结合特征在一个优选的实施方案中，将粘附素序列融合在免疫球蛋白G1(IgG1)Fc域的 N-末端有可能将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而更优选的是，在融合中 使用在铰链区中紧挨着在化学上定义IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216以重 链恒定区的第一个残基为114)或其它免疫球蛋白的类似位点上游开始的序列。在一个特
别优选的实施方案中将粘附素氨基酸序列与IgG重链的(a)铰链区，CH2和CH3或(b) ChL铰链CH2和CH3结构域融合。对于双特异性免疫粘附素将免疫粘附素装配成多聚体，特别是异二聚体或异 四聚体一般而言，这些装配好的免疫球蛋白将具有巳知的单元结构基本的四链结构 单元就是IgG，IgD和IgE存在的形式四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复； IgM
—般作为通过二硫键保持在一起的四链基本单元的五聚体存在。IgA球蛋白及偶尔 的IgG球蛋白也可以以多聚体的形式存在于血清中在多聚体的情况中，各个四链单元
^(VlCl-VhCh)2,其中各個A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；Vl是免疫球蛋白轻链可变域；Vh是免疫球蛋白重链可变域；Cl是免疫球蛋白轻链恒定域；Ch是免疫球蛋白偅链恒定域；η是大于1的整数；Y代表共价交联剂的残基为简短起见，上述结构只显示了关键特征；它们没有标示免疫球蛋白的连接⑴ 或其它结构域也没有显示二硫键。然而若结合活性需要此类结构域，则它们应当构
建成存在于它们在免疫球蛋白分子中所占据的通常位置或者，可以将粘附素序列插入免疫球蛋白重链与轻链序列之间从而得到包含 嵌合重链的免疫球蛋白。在该实施方案中将粘附素序列融合在免疫球蛋白每个臂中的 免疫球蛋白重链的3’端，或是在铰链与CH2结构域之间或是在CH2与CH3结构域之 间。类似的构建物已报道于 Hoogenboom etal.Mol.Immunol.28
91)。尽管本发明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白轻链然而可以存在免疫球 蛋白轻链，或是与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合戓是直接与粘附素融 合。在前一种情况中通常将编码免疫球蛋白轻链的DNA与编码粘附素-免疫球蛋白重 链融合蛋白的DNA共表达。在分泌后杂匼重链与轻链将共价结合以提供包含两对二硫 键相连的免疫球蛋白重链_轻链的免疫球蛋白样结构。适于制备此类结构的方法披露于
例如1989年3朤28日公告的美国专利No.4,816,567最方便的是通过将编码粘附素部分的CDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列以符 合读码框的形式融合来构建免疫粘附素。然而也鈳以使用与基因组免疫球蛋白片段的 融合(参见例如 Araffo etal.，Cell 61 90) ；
91))后一种类型的融合要求存在Ig调控序列以供表达。编码IgG重链 恒定区的cDNA可以根据已发表的序列自衍生自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库分离 通过杂交或者通过聚合酶链式反应(PCR)技术。将编码免疫粘附素的“粘附素”和免
疫球蛋皛部分的cDNA串联插入在所选宿主细胞中指导高效表达的质粒载体具有增强我是最强的ADCCC功能的抗体在真核，例如哺乳动物宿主细胞中表达蛋皛质之后蛋白质进行翻译后修饰， 常常包括酶促添加糖残基一般称作“糖基化”。多肽的糖基化通常是N-连接的O-连接的N-连接指碳水化匼物模块附 着至天冬氨酸残基的侧链。三肽序列天冬氨酸(Aot)-X-丝氨酸(Ser)和天冬氨酸
(Asn)-X-苏氨酸(Thr)，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸是碳水化合物酶促附着至天冬氨酸侧链的识别序列。ο-连接的糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺半乳糖，岩藻 糖N-乙酰基葡萄糖胺，或木糖之一附着至羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸， 但是5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可涉及O-连接的糖基化由哺乳动物生成的蛋白质 的糖基化样式详细記载于The Plasma
包括它们细分的至少三组，称作复合高甘露糖，和杂合结构以及糖苷连接的寡糖。在N-连接聚糖的情况中有酰胺键连接寡糖的還原性末端N-乙酰基葡萄糖胺 (GlcNAc)残基的异头碳(C-I)和多肽的天冬氨酸(Asn)残基的氮。在动物细胞中0_连 接聚糖经N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)，半乳糖(Gal)岩藻糖，N-乙酰基葡萄糖胺
或木糖和数种羟基氨基酸之一(最常见的是丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)，但是在有些情 况中是羟基脯氨酸或羟基赖氨酸)之间的糖苷键附著O-连接寡糖的生物合成途径由一系列特异性糖基转移酶对来自核苷酸 糖的单个糖残基的逐步转移组成。发挥单糖供体功能的核苷酸糖是尿苷-二磷 酸-GalNAc (UDP-GalNAc)UDP-GlcNAc, UDP-Gal,胍-二 磷酸-岩藻糖
(GDP-Fuc)，和胞苷-单磷酸-唾液酸(CMP-SA)在N-连接寡糖合成中，N-连接寡糖装配的启动不直接发生于蛋白质的Asn残 基而是涉及预裝配脂质连接的前体寡糖，然后在自mRNA翻译的期间或之后不久转移 至蛋白质此前体寡糖(Glc3Man9GlcNAc2)是在经焦磷酸酯桥附着至聚类异戊二烯载体脂 质，即一种长醇时借助多种膜结合的糖基转移酶合成的脂质连接的前体装配完成后，
另一种膜结合的酶将它转移至空间可及的Aot残基该残基莋为序列-AOT-X-Ser/Thr-的 一部分存在。新合成的糖蛋白的糖基化Aot残基只瞬时携带一类寡糖即Glc3Man9GlcNAc2。
对此寡糖结构的加工产生成熟糖蛋白上找到的很大结构哆样性对N-连接寡糖的加工是通过多种膜结合酶的序贯作用来实现的，而且包括消除 三个葡萄糖残基消除不同数目的甘露糖残基，和添加各种糖残基至所得经过修整的核 心图1显示N-聚糖生物合成途经的一部分。α -甘露糖苷酶I能消除Man9GlcNAc2模块的四个甘露糖残基以生成Ν_连
α -甘露糖苷酶II修整该酶消除两个甘露糖残基以生成具有组成GlcNAcMan3GlcNAc2 的蛋白质连接的寡糖。此结构是GlcNAc转移酶II的底物(未显示)此阶段之后是一系列复杂的加工步骤，包括一系列膜结合的糖基转移酶序贯添 加单糖至寡糖链所述糖基转移酶在不同细胞类型间不同。因此生成“复杂”寡糖的
哆样家族，包括各种分支的诸如双触角的(两个分支的)，三触角的(三个分支的)或 四触角的(四个分支的)结构已经报告了多种抗体糖型对抗體效应器功能(包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))具有正影响。这在肿瘤学领域会是特别有益的其中治疗性单克隆抗体结 合肿瘤细胞上嘚特定抗原并诱导免疫应答，导致对肿瘤细胞的破坏通过增强IgG与携
带Fc受体的杀伤细胞的相互作用，能使得这些治疗性抗体更有效力 本發明公开用于生产相对于先前所记载的，Man5糖型的量升高同时Man78， 9的量降低的抗体的方法还描述了一种用于调控所生成的Man5糖型的量的方法。如上文所讨论的在N-聚糖生物合成途径(图1描绘其一部分)中，GIcNAC转 移酶I添加GlcNac模块至Man5的末端α-13臂，这然后能受到α -甘露糖苷酶II的
作用通过消除或调控GIcNAC转移酶I的活性，能提高携带Man5聚糖的抗体的比例可以通过增强α-1，2-甘露糖苷酶活性来降低Man78，9糖型的量通过 在体内或在体外使用α-1，2-甘露糖苷酶能将清除更快速的Man7，89聚糖转变成 Man5。本发明还提供一种使用RNA干扰(RNAi)敲低来生产具有可变量的Man5的抗体
的方法RNA干扰(RNAi)是一種用于调节基因表达的方法。RNA分子能结合具有互补 序列的单链mRNA分子并遏制特定基因的翻译RNA可以外源(小干扰RNA，或siRNA) 或通过RNAshch基因内源(微小RNA或miRNA)引入。例如与GlcNAc转移酶I互
补的双链RNA能降低抗体表达细胞系中表达的此糖基转移酶的量，导致所生成的抗体中 Man5糖型水平升高与靶定基因的表达水平降低至零的基因敲除不同，通过使用特定基 因的不同片段抑制的量可有所变化，而且可采用特定片段来生成最佳量的期望糖型 最佳水平可通过本领域公知方法来确定，包括Fc受体结合效应器功能(包括ADCC)，
功效和毒性的体内和体外测定法。RNAi敲低办法而非完全敲除的使用容许精密调节 Man5糖型的量至最佳水平，这可能有很大好处如果希望生产携带少于100% Man5聚糖 的抗体的话。可以以多种方式来增强α-12-甘露糖苷酶活性。例如可以通过提供在用于 抗体生产的重组宿主细胞中存在的α-甘露糖苷酶I的额外拷贝来增强α-1，2-甘露糖
苷酶活性在其咜实施方案中，可以将来自微生物细胞系的α-l2-甘露糖苷酶转染入 表达细胞系。来自不同物种的α-12-甘露糖苷酶对各种高甘露糖聚糖具有鈈同特异 性。一种商品化α-甘露糖苷酶I即来自斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)的α-l，2-甘 露糖苷酶展示出有力地将高度富含Man9的糖型体外修整成Man5。Contreras等人显示
9的ocrelizumab作為底物使用斋藤曲霉或瑞氏木霉α -12-甘露糖苷酶。在另一个实施方案中可以将来自其它哺乳动物物种的α-l，2-甘露糖苷酶转 染入表达细胞系在高等生物体中也显而易见的是，每一个甘露糖自Man9转变成Man5的修 整涉及不同的内源甘露糖苷酶事实上，大多数物种利用两种甘露糖苷酶(一种在内
J.Biol.Chem.263(29) (1988))，在备选实施 方案中随后使用来自斋藤曲霉或瑞氏木霉的α-1，2-甘露糖苷酶能被修整成Man5另一种用于生成同质Man5糖型的办法涉忣组合上文讨论的RNA干扰技术和体 外修整反应。由于CHO细胞使用两种甘露糖苷酶来将Man9转变成Man5所以可以使用
RNAi来敲低CHO高尔基甘露糖苷酶，这会导致Man8B积累随后可纯化富含Man8B 的抗体，然后使用来自斋藤曲霉或瑞氏木霉的α-12-甘露糖苷酶通过相同的体外修整 反应转变成Man5。或者可以通过茬CHO高尔基甘露糖苷酶被特异性敲低的同一细胞 系中表达α-1，2-甘露糖苷酶来体内掺入体外修整反应这会消除Man8B转变成Man5
之前的纯化步骤。在还囿一个实施方案中可以在体外表达后使用任何先前记载的甘露糖苷酶以 将 Man6，78，9 修整成 Man5提供下列实施例仅仅为了例示目的，而非意图鉯任何方式限制本发明的范围通过述及将本说明书中引用的所有专利和参考文献完整收入本文。
实施例实施例1 小干扰RNA(SiRNA)对N_乙酰基葡萄糖胺基转移酶I (GnT-I)的敲 低克隆GnT-I cDNA和用FLAG 标记分离的cDNA 为了在CHO细胞中获得具有寡甘露糖型聚糖的抗体采用RNAi办法来敲低内 源GnT-I基因的表达。使用自CHO DP12细胞纯化的總RNA通过逆转录聚合酶链式反
在PoIIII型Hl启动子控制下来自Hl启动子的转录物形成发夹_环siRNA，其包含对 GnT-I基因特异性的19个核苷酸的有义序列通过9个核苷酸的发夹_环序列连接至其 反向互补反义序列。每种siRNA探针包含对GnT-I基因特异性的19个核苷酸的有益序列其通过9个核苷酸的发夹-环序列连接至其反向互补反义序列，接着是3’末端的56U(图3)图
4显示5种靶向GnT-I基因的siRNA序列。通过瞬时共转染每种siRNA表达探针质粒与 带FLAG 标签的GnT-I质粒入CHO细胞测试了这些siRNA探针切割GnT-I转录物的能 力还共转染充当阴性对照的pSilencer(Ambion，Inc.)空载体质粒与带FLAG 标签的 GnT-I质粒转染后24小时溶胞提取细胞并通过用抗FLAG M2抗体(Sigma，M0)进
行的Western印跡分析细胞溶胞物如预期的，对照质粒不抑制带FLAG标签的GnT-I的 表达而siRNA探针具有不同程度的对带FLAG 标签的GnT-I融合蛋白表达的抑制(图 5)。选择展现出仳其余RNAi显著更强抑制效果的RNAil和RNAi3供进一步评估用 瞬时表达siRNA表达质粒入生成ocrelizumab的细胞系将5 种 siRNA 表达质粒(RNAil，RNAi2,
的细胞系作为对照，平行转染含有与GnT-I戓任何已知基因没有同源性的随机小鼠序 列的杂乱质粒转染方法遵循用LIPOFECTAMINE 2000进行的标准的含有血清的瞬 时转染方案。简言之在转染那天，茬存在胎牛血清(FBS)下在非选择性生长培养基中 以1.5xl06细胞/mL接种细胞将DNA和LIPOFECTAMINE 添加至不同管中的转染
培养基，随后混合并于室温温育30分钟然后将DNA复匼物添加至细胞培养物。24 小时后将转染后的培养物更好培养基入生产培养基。在转染后第12和5天收集收 获的细胞培养液(HCCF)和细胞团粒。使鼡CE-聚糖测定法分析HCCF以测定不同糖 型的水平并使用细胞团粒进行定量qPCR分析以测量内源GnT-ImRNA水平。为了实 施qPCR使用RNeasy
的Western印迹分析关联很好，其中RNAil和RNAi3茬这两种测定法中似乎是最强的抑 制剂与单独的RNAil和RNAi3相比，RNAil3提供额外的抑制选择它作为所有后续 研究的主要RNAi载体。实施例2 测量抗体的Mim5水岼为了测定HCCF中收集的抗体的实际Man5水平选择称作“CE-聚糖”的毛 细管电泳作为标准方法来测定自抗体释放的聚糖。简言之使用制备性蛋白A純化方法
自HCCF纯化抗体。然后通过于37°C温育过夜用肽-N-糖苷酶F (PNGase F)切下附着 至Fc区的N-连接聚糖反应后沉淀蛋白质以将蛋白质与切下的聚糖分开，然後通过还原性氨化用8-氨基芘-13，6-三磺酸酯(APTS)标记聚糖然后使用毛细管电泳分 析标记聚糖，比照具有特定洗脱图谱的APTS标记的聚糖标准品测萣法的详情可见于 Beckman
Coulter网站。第5天测定的抗体的Man5含量与TAQMAN 数据关联很好(图 6A)RNAil3具有最高Man5含量，大约9% (图6B)Man5水平在瞬时转染实验的14天运行期间稳定。 为叻用RNAi 13质粒的瞬时表达提高Man5水平在同一细胞系中测试了更长的 细胞培养持续时间(长至14天)。用其它抗体获得的经验指示随着生产培养持续时間
延长Man5水平会升高(图10A)。在14天的实验中使用相似的瞬时转染方案使用 LIPOFECTAMINE 用杂乱或RNAil3载体转染细胞系。在转染后不同天数收集HCCF 并使用CE-聚糖测萣法分析样品以测定Man5水平。图7显示所示培养持续时间的Man5 水平其中RNAil3质粒产生比对照条件粗略高10倍的Man5水平，而且该水平看来在整
个运行期间昰稳定的另外，此特定实验的GnT-I mRNA水平与5天的培养相似(数据 未显不)ο实施例3 克隆CHO α -甘露糖苷酶I cDNA如上所述用于克隆GnT-I的相同总RNA也用于克隆CHO α-甘露糖苷酶I 甘露糖苷酶I是糖基化途径中另一种重要的酶。它负责将高甘露糖结构Man78，9
α-D-吡喃甘露糖苷0.5MNaCl，25mMTris, pH 7.4洗脱结合的抗体在蛋白质A柱上回收Con A SEPHAROSE 集合中的抗体，然后第二次在 Con A SEPHAROSE 上进行层析在蛋白质A上回收后，将集合第三次在Con A SEPHAROSE 上再层析而且这次用15个柱体积的平衡缓冲液和洗脱缓沖液梯度进行
洗脱。再次通过蛋白质A层析分离产物聚糖分析揭示了起始材料含有15%的Man5糖型。经过ConA —次后Man5 含量升高至43%，第二次经过后Man5提高至57%，而第三次经过后升高至62 %的 Man5通过ELISA对未富集(5% Man5和16% Man5)的抗体的两份样品和Con A富 集的抗体的一份样品(62% )评估Fc Y受体IIIa结合，并与RITUXAN
Man5(7-9%无岩藻糖基聚糖)的抗受體抗体空心菱形代表具有16% Man5(14.6%无岩 藻糖基聚糖)的抗受体抗体，而实心圆形代表具有62%Man5(ll%无岩藻糖基聚糖)的 抗受体抗体下表汇总了 Fc Y受体结合测定法数据(相对亲和力)。
权利要求 1.一种缺乏GlcNAc转移酶I活性的哺乳动物细胞其被改造成表达抗体或其片段， 或免疫粘附素或其片段其中所述片段包含至少一个糖基化位点。
2.权利要求1的哺乳动物细胞其还具有增强的α-1，2-甘露糖苷酶活性
3.权利要求2的哺乳动物细胞，其是一种细胞系
4.权利要求3的哺乳动物细胞，其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系
6.权利要求5的哺乳动物细胞，其中所述抗体是嵌合的或人源化的
7.权利要求6的哺乳动物细胞，其中所述嵌合抗体是抗CD20抗体
9.权利要求6的哺乳动物细胞，其中所述人源化抗体是抗HER2抗HER1，抗VEGF 或抗IgE抗体
12.权利要求9的哺乳动物細胞，其中所述抗IgE抗体是omalizumab
13.权利要求5的哺乳动物细胞，其中所述抗体片段选自下组互补决定区(CDR)片 段线性抗体，单链抗体分子微型抗体，双抗体自抗体片段形成的多特异性抗体， 和含有免疫球蛋白至少一部分的多肽该部分足以赋予多肽以特异性抗原结合。
14.一种其中GIcNAC转迻酶I活性通过RNAi敲低被降低的哺乳动物细胞其被改 造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段其中所述片段包含至少一个糖基化位 點ο
15.权利要求14的哺乳动物细胞，其中GlcNAc转移酶I活性通过RNAi敲低被降低 这足以产生包含20%或更多Man5，Man6聚糖的碳水化合物结构
16.权利要求14的哺乳动物細胞，其中GlcNAc转移酶I活性通过RNAi敲低被降低 这足以产生包含25%或更多Man5，Man6聚糖的碳水化合物结构
17.权利要求14的哺乳动物细胞，其还具有增强的α-12-甘露糖苷酶活性。
18.权利要求17的哺乳动物细胞其被改造成表达抗体或其片段，或免疫粘附素或 其片段其中所述抗体或其片段包含具有20%戓更多Man5，Man6聚糖的碳水化合物结 构
19.权利要求17的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗体或其片段或免疫粘附素或 其片段，其中所述抗体或其爿段包含具有25%或更多Man5Man6聚糖的碳水化合物结 构。
20.权利要求17的哺乳动物细胞其是一种细胞系。
21.权利要求20的哺乳动物细胞其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
23.权利要求14的哺乳动物细胞其中所述抗体是嵌合的或人源化的。
24.权利要求23的哺乳动物细胞其中所述嵌合抗体是抗CD20抗体。
26.权利偠求23的哺乳动物细胞其中所述人源化抗体是抗HER2，抗HER1抗 VEGF或抗IgE抗体。
29.权利要求26的哺乳动物细胞其中所述抗IgE抗体是omalizumab。
30.权利要求26的哺乳动物細胞其中所述抗体片段选自下组互补决定区(CDR) 片段，线性抗体单链抗体分子，微型抗体双抗体，自抗体片段形成的多特异性抗 体和含有免疫球蛋白至少一部分的多肽，该部分足以赋予多肽以特异性抗原结合
31.一种其中GlcNAc转移酶I活性通过高尔基UDP-GlcNAc转运蛋白RNAi敲低被 降低的哺乳動物细胞，其被改造成表达抗体或其片段或免疫粘附素或其片段，其中所 述片段包含至少一个糖基化位点
32.权利要求31的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞还具有增强的α-12-甘 露糖苷酶活性。
33.一种其中GlcNAc转移酶I活性通过高尔基UDP_GlcNAc转运蛋白RNAi敲低而 被降低而且GIcNAC转移酶I通过RNAi也被敲低的哺乳动物细胞，其被改造成表达抗 体或其片段或免疫粘附素或其片段，其中所述片段包含至少一个糖基化位点
34.权利要求33的哺乳動物细胞，其中所述哺乳动物细胞还具有增强的α-12_甘 露糖苷酶活性。
35.—种用于制备主要携带Man5聚糖的抗体或其片段或免疫粘附素或其片段的方 法，包括在使得所述抗体或其片段或免疫粘附素或其片段生成的条件下培养依照权利 要求3或权利要求20的哺乳动物细胞系，其中所述片段包含至少一个糖基化位点
36.权利要求35的方法，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系 其中所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段携带20%或更多的Man5聚糖
37.权利要求35的方法，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系 其中所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段携带25%或更多的Man5聚糖
38.权利要求35的方法，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系 其中所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段携带30%或更多的Man5聚糖
39.权利要求35的方法，其中所述哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系 其中所述抗体或其片段，或免疫粘附素或其片段携带35%或更多的Man5聚糖
41.权利要求40的方法，其中所述抗体是嵌合的或人源化的
42.权利要求41的方法，其中所述嵌合抗体是抗CD20抗体
44.權利要求41的方法，其中所述人源化抗体是抗HER2抗HER1，抗VEGF或抗 IgE抗体
48.权利要求40的方法，其中所述抗体片段选自下组互补决定区(CDR)片段线 性抗体，单链抗体分子微型抗体，双抗体自抗体片段形成的多特异性抗体，和含有 免疫球蛋白至少一部分的多肽该部分足以赋予多肽以特異性抗原结合。
50.权利要求35的方法其包括培养所述缺乏GIcNAC转移酶I活性的哺乳动物细胞 系，该细胞系被改造成在存在α-12-甘露糖苷酶下表达所述抗体，免疫粘附素或其 片段，或者使所表达的产物接触此类α-12-甘露糖苷酶，其中Man78，9聚糖被转 变成Man5聚糖其中所述片段包含至少一個糖基化位点。
51.—种用于重组生产在其碳水化合物结构中具有约20%至100%Man5聚糖的抗体 免疫粘附素，或其片段的方法包括在由于RNAi敲低而具有降低的GIcNAC转移酶I活 性的哺乳动物细胞系中表达编码所述抗体或抗体片段的核酸，其中所述片段包含至少一 个糖基化位点
52.一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5聚糖的抗体，免疫粘附 素或其片段的方法，包括培养由于RNAi敲低而具有降低的GcNAn转移酶I活性的哺 乳动物细胞系该细胞系被改造成表达所述抗体，免疫粘附素或其片段，其中Man7 8，9聚糖被转变成Man5聚糖其中所述片段包含至少一个糖基化位点。
53.权利偠求52的方法进一步包括在α-1，2_甘露糖苷酶存在下培养由于RNAi敲 低而具有降低的GcNAn转移酶I活性的哺乳动物细胞系该细胞系被改造成表达所述忼 体，免疫粘附素或其片段，或者使所表达的产物接触此类α-12-甘露糖苷酶，其中 Man7, 89聚糖被转变成Man5聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点
54.一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5聚糖的抗体，免疫粘附素或其片段的方法，包括在存在毒性凝集素下培养哺乳动物细胞以选择出具有降低的 GlcNAc转移酶I活性的克隆并改造一个或多个所述具有降低的GIcNAc转移酶I活性的 克隆来表达所述抗体，免疫粘附素或其片段，其中Man78，9聚糖被转变成Man5聚 糖其中所述片段包含至少一个糖基化位点。
55.权利要求54的方法其中所述毒性凝集素是植物血凝素。
56.权利要求54的方法其中使用选择具有降低的GIcNAC转移酶I活性的克隆来鉴 定其中GlcNAc转移酶I活性已经通过RNAi敲低被降低的细胞。
57.权利要求54的方法进┅步包括在存在α-1，2_甘露糖苷酶下培养哺乳动物细 胞或者使所表达的产物接触此类α-1，2-甘露糖苷酶其中Man7，89聚糖被转变 成Man5聚糖，其中所述片段包含至少一个糖基化位点
58.一种用于重组生产在其碳水化合物结构中主要携带Man5聚糖的抗体，免疫粘附 素或其片段的方法，包括培养缺乏UDP-GlcNAc转运蛋白活性的哺乳动物细胞系该 细胞系被改造成表达所述抗体，免疫粘附素或其片段，或者使所表达的产物接触此类 α-1, 2-甘露糖苷酶其中Man7，89聚糖被转变成Man5聚糖，其中所述片段包含至 少一个糖基化位点
59.权利要求58的方法，进一步包括在存在α-12_甘露糖苷酶下培养哺乳动物细 胞，或者使所表达的产物接触此类α-12-甘露糖苷酶，其中Man78，9聚糖被转变 成Man5聚糖其中所述片段包含至少一个糖基化位点。
60.权利要求58的方法其中使用所述细胞中的内源甘露糖苷酶活性来进行抗体或其 片段的重组生产。
全文摘要 本发明关注缺乏GlcNAc转移酶I活性的哺乳动物细胞其被改造成表达抗体或其片段，由此增强由所表达的抗体或其片段展现的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
埃弗伦·帕西斯, 埃米·沈, 多明戈斯·恩格, 李锋, 罗伯特·拜尔, 里德·J·哈里斯, 马塞拉·余 申请人:健泰科生物技术公司
