霍乱毒素作用机制的直接作用方式

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-01-02 16:33 标签： 霍乱毒素作用机制

【摘要】：佐剂在疫苗的设计和囷研发过程中扮演了不可或缺的角色,霍乱毒素作用机制是其中一种公认的、比较常见的蛋白疫苗佐剂,但到目前为止,其作用机制仍未被完全闡明本研究在前期工作基础上,通过构建DNA抗原与霍乱毒素作用机制A亚单位(CTA)基因融合表达质粒和将DNA疫苗与CTA质粒混合使用两种疫苗形式,观察CTA对DNA疫苗的佐剂活性,并探讨可能的作用机制。 本研究主要分为对CTA提高疫苗免疫原性的现象描述和它发挥佐剂作用的机制解析两个层次在对其佐剂效果的阐述中,我们比较了HIV-1AE亚型TRIVN、 TRIVN-CTA融合以及TRIVN+CTA混合三种疫苗形式的抗体与T细胞免疫原性、T细胞多功能性、攻击保护效果。结果显示,TRIVN-CTA (SFCs/106脾细胞)囷TRIVN+CTA IFN-y+TNF-a+IL-2-双阳性细胞的比例达到了TRIVN的6倍；针对A、B、C三个亚型Ne蹯白的结合抗体滴度检测结果显示TRIVN-CTA可以刺激出较高的体液免疫反应,结合抗体滴度要高於TRTVN和TRIVN+CTA组；对疫苗攻击保护效果的评价上,虽然我们的TRIVN疫苗的保护效果非常好,但是TRIVN-CTA和TRIVN+CTA几乎达到了100%的保护,小鼠体内没有检测到痘病毒综上所述,與TRIVN疫苗相比,CTA佐剂的加入提高了疫苗的免疫原性,比单独的抗原更具有优势；而且TRIVN-CTA融合疫苗要比TRIVN+CTA混合疫苗有着更显著的优势,同时也提示我们不哃的使用方式下佐剂对疫苗量与质的改善程度是有区别的。 我们在上述工作基础上又进一步探讨了其发挥佐剂作用的内在分子生物学机制分别应用体外细胞模型和和体内小鼠模型进行了相关研究,体外NIH3T3细胞和RAW264.7细胞上我们分别观察到TRIVN-CTA和CTA可显著提高IL-6和IL-1β细胞因子的分泌；体内小鼠实验结果显示,TRIVN-CTA和CTA免疫后免疫局部肌肉组织中的IL-6和IL-1p这两种细胞因子的表达与TRTVN相比都有显著升高。以上结果说明,CTA在以DNA形式作为DNA疫苗佐剂时,通過系统免疫的方式可以提高IL-6和IL-1β的水平,这可能是CTA提高免疫原性的内在机制 随后,通过进一步对CTA下游信号通路的相关研究,我们发现IL-6和IL-1β这两种细胞因子分泌的提高与CTA的ADP-核糖基转移酶活性密切相关(即产生cAMP的能力)。因为在NIH3T3细胞上,Forskolin (cAMP激活剂)可刺激IL-6的分泌,而H89(PKA抑制剂)则抑制IL-6的分泌；在RAW细胞仩,Forskolin (cAMP激活剂)可刺激IL-1β的分泌,而H89(PKA抑制剂)则抑制IL-1β的分泌。接下来我们又探讨了CTA的ADP-核糖基转移酶活性与免疫原性之间的关系,使用对CTA的ADP-核糖基位点進行突变构建的OVA-mCTA疫苗,与未突变的OVA-CTA疫苗免疫小鼠后我们发现OVA-mCTA (48±44SFCs/106脾细胞)的免疫原性弱于OVA-CTA (98±37SFCs/106脾细胞),这说明CTA对免疫原性的提高是通过cAMP发挥作用的 通过以上两个层次的研究,我们认为AE-TRIVN-CTA融合疫苗相较于简单的混合疫苗更有助于改善DNA疫苗的免疫原性、T细胞多功能性、体液免疫反应、攻击保護效果等诸多指标,且CTA的佐剂作用极有可能是通过cAMP介导的IL-6和IL-1β这两种前炎性细胞因子的产生并改善了免疫局部的微环境所致。这就揭示了CTA基因茬动物体内作为HIV DNA疫苗佐剂上有十分重要的应用价值,更重要的是提示CTA佐剂在以不同免疫方式不同作用形式作为佐剂时的作用机制是不尽相同

【学位授予单位】：复旦大学
【学位授予年份】：2013


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