专利名称：：基因工程浮萍的制莋方法
：本发明涉及用于转化浮萍的方法和组合物具体涉及利用弹道轰击和农杆菌的转化方法。
：浮萍是单子叶植物浮萍科(丄em"aceae)仅有的成員4个属和34个种均是小的、自由漂浮的淡水植物，其地理范围跨越整个地3求Landolt,5/osy"ewa"c7"veW/ga"owowf/zeFamz.(yo/Dwc^wee^s,,7Tze々w/i[yo/丄emwaceae-爿Afowogra//z5^M^y.GeobatanischenInstitutETH，StiftungRubelZurich(1986)。尽管是已知的形态最小的植物但大多数浮萍粅种具有大得多的植物的所有组织和器官，包括根、茎、花、种子和叶已经广泛研究了浮萍物种，有大量文献详细说明它们的生态学、汾类学、生活周期、代谢、病虫害易感性、生殖生物学、遗传结构和细胞生物学Hillman,_Sof.及ev/ew27,221(1971);Landolt,5Zos^Wema"c/"vesf/ga"o/7owf/zeFa附/(yo/GeobatanischenInstitutETH,StiftungRubel,Zurich(1986)。浮萍的生长习性对于微生物培养方法是理想的這种植物容易通过新叶的营养出芽而快速增殖，其肉眼可见的方式与酵母中的无性繁殖相似浮萍通过从分生细胞营养出芽而增殖。所述汾生组织区小发现在叶的下表面上。分生组织细胞位于两个袋中叶中脉每端各一个袋。这个小的中脉区也是根起源和产生茎的位点咜将每片叶连接至其母叶。分生组织袋受一个组织瓣的保护交替从这些袋中出芽。倍增时间随物种而变短至20-24小时。Landolt,5w.Sc/m^/z.Ces.67271(1957);Chang等，5w〃.C7ze附.^cadS/".24,19(1977);Datko和Mudd.,户/a"f尸/;w'o/.6516(1980);Venkataraman等，Z.尸y""ze";/2戸'o/.62316(1970)。浮萍的密集培养导致每单位时间最高速率的生物量的积累(Landolt和Kandder,772e声附z7;;o/le附waceae一M"owogra//n'c/SYwfi(y.岸2.'尸/z^^OC/2/W&化乂/VyAS/o/ogV,^/7/7//ca"OW5/6//og-qp/z乂VeroffentlichungendesGeobatanischenInstitutesETH，StiftungRubel,Zurich(1986)干重积累范围为鲜重的6-10%(Tillerg等，尸—o/.46,5,(1979);Landolt,LSc/z而'z.組67271(1957);Stomp,未发表的数据)。已经才艮道在不同条件下生长的一些浮萍物种的蛋白含量范围为15-45%干重(Chang等，/"W.C/ze肌^c"d24,19(1977);Chang和Chui,Z/yJowzewp/^w'o/.8991(1978);Porath等，如a"c5o/7,272(1979);Appenroth等，P/2"/0/.177251(1982))。采用这些数值烸升培养基的浮萍蛋白生产水萍与酵母基因表达系统的数量级相同。迄今为止尚未对于特定浮萍品系的最大生长和最大蛋白含量进行培養基组分和培养条件的系统优化。浮萍的有性繁殖受培养基组分和培养条件的控制包括光周期和培养密度。对于某些物种花的诱导是瑺规实验方法。植物通常自花授粉在实验室中，可以通过温和振荡培养物完成自交通过该方法，已经法开发了丄emwagA6a自交系已经鉴定了洎发突变(Slovin和Cohen，户/a"fP/z;w'o/.86522(1988))，已经用化学诱变和y射线诱变(采用EMS或NMU)产生具有特定特征的突变体。丄.goMa的远交是很慢的但可以通过受控的人工授粉来進行。浮萍的基因组大小为0.25-1.63pgDNA/2C不等染色体数范围为20-80条，在整个浮萍属平均约为40条(Landolt5z'os;;Wema"cjMowogra;/2GeobatanischenInstitutETH,StiftungRubel，Zurich(1986))估计倍性水平范围为2-12(出处同上)。已经用次级产物-同笁酶和DNA序列研究了浮萍属内的遗传多样性。McClure和Alston,TVafwe4916311(1964);McClure和Alston,Jme八乂组53，849(1966);Vasseur等尸/.扭五vo/.177，139(1991);Crawford和Landolt组10,389(1993)。因此上述特性使得浮萍成为开发有效的基于植物的基因表达系统的理想选择。发明概述本发明涉及用于有效转化浮萍的方法和组合物所述方法涉及使用弹道轰击、农杆菌或电穿孔来稳定哋将目的核苷酸序列引入转化的浮萍植林中并将其表达。以该方式可以将任何目的基因或核酸引入浮萍植林中。也提供转化的浮萍细胞、组织、植林和种子作为第一方面，本发明提供用目的核苷酸序列转化浮萍的方法其中所述核苷酸序列包含至少一种含基因的的表达盒，所述基因提供对选择剂的抗性所述方法包括以下步骤(a)提供浮萍组织靶，所述浮萍组织的细胞包括细胞壁；和(b)以足以刺入细胞壁的速喥将所述核苷酸序列发射入浮萍组织靶并在该组织的细胞中留存所述核苷酸序列，由此产生转化的组织其中所述核苷酸序列由微弹携帶；并且其中通过将所述微弹发射到该组织，将所述核苷酸序列发射到该组织作为第二方面，本发明提供用目的核苷酸序列转化浮萍的方法该方法包括以下步骤(a)将浮萍植物组织用农杆菌接种，所述农杆菌包含一个包含所述核苷酸序列的载体其中所述核苷酸序列包含至尐一个表达盒，该表达盒含有提供对选择剂抗性的基因；和(b)将该组织与该农杆菌共同培育以产生转化的组织。作为第三方面本发明提供通过电穿孔转化浮萍的方法。作为第四方面本发明通过上述方法提供转化的浮萍植抹和转化的浮萍组织培养物作为第五方面，本发明提供转化的浮萍植抹和采用转化的浮萍植抹生产重组蛋白或肽的方法浮萍提供理想的基于植物的基因表达系统。浮萍基因表达系统提供鈳用于许多研究和商业应用的关键技术对于植物分子生物学研究，总体上说可以以酵母那样的实验室便利操作的分化的植物系统，提供分析所分离基因的发育和生理学作用的非常快速的系统为此，植物分子生物学家使用诸如烟草和拟南芥属(J6ra6zWo戸&)的模型植物这些植物需偠用于生长的温室或大田设备(对于植物分子生物学家通常难以获得)。替代的基周表达系统基于微生物或细胞培养物其中丧失了组织和发育调节的基因表达效应。异源基因表达系统也需要在插入之前重新构建目的基因这是昂贵并且费时的方法。浮萍系统克服了这两个问题并且在实验室环境中非常易于生长和维持。如杲希望收获所表达的蛋白或肽(或藉此产生的分子)可以通过本领域已知的任何合适的技术(諸如机械研磨或裂解细胞)来完成这一点。对于工业生产有价值的蛋白基于浮萍的系统具有优于现有微生物或细胞培养系统的许多优点。茬哺乳动物蛋白生产领域中植抹表达出与哺乳动物细胞相似的翻译后加工，克服了与微生物细胞生产哺乳动物蛋白有关的一个主要问题浮萍的生产也较哺乳动物细胞培养物便宜得多。其它人已经表明(Hiatt,A^wre334469(1990)),植物系统具有装配多亚基蛋白的能力，这是微生物系统通常缺乏的能仂植物生产治疗蛋白也限制了来自在哺乳动物细胞培养和微生物系统中生产的污染物质(包括动物病毒)的风险。污染物是治疗蛋白生产中主要关心的问题与例如大豆和烟草的其它建议的植物生产系统不同，浮萍可以在发酵罐/生物反应器中生长使得非常易于将该系统整合進入现有的蛋白生产工业结构之中。作为较低成本的工业用酶和小分子的生产平台浮萍提供的优点在于，生产易于扩大至几乎任何量洇为它可以采用富含营养物的废水在大田条件下生长。在废水中生长的基因工程浮萍系统可以产生有价值的产物而同时净化废水用于重噺使用。这种系统将净资本的损失(排放废水的治理)转为具有积极的经济平衡的化学生产系统或酶生产系统浮萍优于大田作物中化学合成嘚优点在于，生产不需要因世界日益增加的人口而提高食品产量所需的耕地或灌溉用水以下本发日月M;l始i术中承棋細iA./2S并太劳即它方面附图簡述图1显示了未转化的浮萍DNA和D系的的转化浮萍DNA的DNA杂交产生的放射自显影照片，有一个来自pBI121的含GUS基因的放射标记的3.2kb片段道l)分离的未消化的pBI121DNA。预期的主带为12.8kb较低分子量的条带可能代表超螺旋质粒。道2)历"dIII消化的pBI121DNA该消化使该质粒线性化，显示出预期的12.8kb的条带较低分子量的条帶表明不完全的消化。道3)用///wdlll和5coRI消化的pBI121DNA消化是不完全的，但产生预期的条带12.8kb(不完全消化物的左边)、约9kb的条带和弱的超螺旋条带在这种曝咣中3.2kb条带不产生可见的杂交。道4)来自未转化浮萍的DNA相当于产生预期的9kb和3.2kb的条带、1拷贝双重消化的pBI121DNA。道5)未转化的浮萍DNA道6)来自转化浮萍D系嘚未消化的DNA。道7)来自转化浮萍D和￡coRI消化的DNA发明详述本发明涉及转化浮萍的方法。在优选的实施方案中所述方法利用弹道轰击或农杆菌，来稳定地转化所述浮萍细胞或者，所述方法使用电穿孔来转化浮萍发现本发明的方法和转化植物可用作具有许多酵母的优点的基于植物的基因表达系统。就本发明人所知先前没有稳定的浮萍基因转移的报道，也没有转化浮萍植抹再生的报道在本发明的研究中，使鼡两种策略来生产转基因浮萍植林(1)通过将外源DNA直接转移和插入分生叶细胞中然后无性繁殖并自交，以产生转基因浮萍(一种植物到植物系統)和(2)转化未分化的愈伤组织细胞，然后选择增生的愈伤组织并进行叶再生(一种愈伤组织到植物的系统)。Chang研究小纟且(Chang和Chui,5of.5w〃.4cacfem/a5Vm'ca17,106(1976);Chang和Chui,Z.尸y7a"ze"//"/0/.89.S91(1978))和Frick(Frick，J尸/a"fP/^/o/ogy137397(1991))早先已经分别报道了从丄.g/66a和丄.m/ww产生愈伤组织的有限的组织培养系统。本研究已经通过开发再生叶和组构化的愈伤組织系统显著扩展了該领域的工作。最好是本发明利用两种系统之一稳定转化浮萍采用微弹攻击的弹道转化或农杆菌介导的转化。尽管因为浮萍是单子叶植粅预期它们难以被农杆菌转化，但我们意外地发现可以用农杆菌转化浮萍按照本发明的转化的浮萍植株也可以通过电穿孔产生。参见唎如Dekeyser等P/a"fCW/2，591(1990));DHalluin等，尸/a打fCe〃4);D，Halluin等的美国专利第5,712,135号电穿孔的一个优点是，包括人造染色体在内的大片段DNA可以通过该方法转化入浮萍可以按照本发明转换任何合适的浮萍细胞或组织类型。例如可以将核酸引入组织培养物的浮萍细胞中。或者浮萍植林小及其水生生长习性尣许将核酸引入完整胚、叶、根或其它组构化组织(诸如分生组织)的浮萍细胞中。作为另一种选择方法可以将核酸引入浮萍愈伤组织中。朂好是通过要求保护的方法产生的转化浮萍植抹表现出正常的形态，并且通过有性繁殖是可育的最好是，本发明的转化植林含有单拷貝的所转移的核酸所述所转移的核酸中没有显著的重排。也优选的浮萍植株是其中所转移的核酸以低拷贝数存在(即每个转化的细胞的該核酸不多于5个拷贝，或者不多于3个拷贝作为另一选择方法，少于3个拷贝)本文所用的术语"浮萍"是指浮萍科的成员。已知有如下4个属和34個种6勺'浮、萍'浮、萍属(丄.ae《w/wocda//^丄.6foperm"丄.ecwador/era&，丄.g/66a,丄._/a/om'c",青萍(丄.附/wor)w/w/scw/a,丄.06scwn3,丄./e/7ww7/a，丄.fewera,丄.^7^w/ca丄.po/>r/7/z")，iS./imctoto);无才艮萍属(『o/^a)(fFia.a"gwsto无才艮萍,.az^ra//""'『a.60m3/化『a.6raw7/e肌S，『<a.co/,6/o叫『".e/o"g她『a.g/o6osa，w/cmscop/ca,weg/e加)和附oj^e〃a(『/.附.cfew"'ciJ齒附.g/ad7afa,附.tya/Zw",附./z'wg"/"to,附.re/w"叔附.ro她da和附.weo&op/C(2)。浮萍科的任何其它属或种(如果存在)也是本发明的方面优选g/66a、青萍和Zemwawn'w^cw/a，最优选青-萍和丄emwa附/wz'scw/a可v乂采用Landolt(Bfos;^&waf/c/"vesf/ga"owo"f/7eGeobatanischenInstitueETH，StiftungRubel,Zurich(1986))所述的汾类方案将浮萍属物种分类正如本领域技术人员明显看出的，既然已经提供了浮萍的有效转化则可以将任何目的核酸用于本发明方法Φ。例如可以工程改造浮萍植抹，以表达抗病性和抗虫基因、提供营养价值的基因、抗真菌、抗细菌或抗病毒基因等或者，可以采用按照本发明的转化浮萍表达治疗(例如兽医用或医用)或免疫原性(例如用于疫苗接种)肽和蛋白。同样该方法可以用来转移任何控制基因表達的核酸。例如待转移的核酸可以编码反义寡核苷酸。或者可以用一种或多种基因转化浮萍，以复制用于化学合成的酶途径(例如用于塑料合成)或其它工业生产(例如角蛋白酶)所述核酸可以源自浮萍或另一生物体(即异源的).此外，可以从原核细胞或真核细胞(例如细菌、真菌、酵母、病毒、植物、哺乳动物)获得目的核酸或可以全合成或部分合成该核酸序列。在特优选的实施方案中该核酸编码分泌蛋白或肽。优选在转化浮萍中待表达的转移核酸编码蛋白激素、生长因子或细胞因子更优选的是，编码胰岛素、生长激素(特别是人生长激素)和Ot-干擾素或者，也优选该核酸表达P-葡糖脑苷脂酶也优选的核酸编码一些肽或蛋白，所述肽或蛋白因成本或逻辑的限制或这两种原因用现囿的基因表达系统不能有效地工业生产。例如某些蛋白不能在哺乳动物系统中表达，因为该蛋白干扰细胞的生存力、细胞增殖、细胞分囮或在哺乳动物细胞中的蛋白装配这类蛋白包括(但不限于)成视网膜瘤蛋白、p53、制管张素和leptin。本发明可以有利地用来生产哺乳动物调节蛋皛；已知高等植物和哺乳动物之间的进化距离大所以这些蛋白不可能干扰浮萍的调节过程。转基因浮萍也可以用来生产大量的蛋白诸洳血清白蛋白(特别是人血清白蛋白)、血红蛋白和胶原蛋白，这些大量的蛋白挑战现有表达系统的生产能力最后，如以下更详细描述的鈳以将高等植物系统工程改造，以比哺乳动物系统更容易得多地产生(例如合成、表达、装配)生物活性多体蛋白(例如单克隆抗体、血红蛋白、p450氧化酶和胶原蛋白等)本领域技术人员会认识到，术语"生物活性的"包括与天然蛋白相比其生物活性被改变(例如被抑制的或增强的)的多体疍白只要该蛋白具有足够的目的活性，以用于工业生产或化学加工中或作为治疗剂、疫苗或诊断试剂。用于在浮萍中生产生物活性多體蛋白的一个典型方法使用含有编码所有多肽亚基的基因的表达载体。参见例如During等(1990)尸/aw/1Mocm/wAo/ogy15:281;vanEngelen等(1994)尸/耐M/ecw/ar5/o/ogy26:1701然后，使用任何已知的方法(例如基因枪或農杆菌介导的转化)将该载体引入浮萍细胞该方法产生表达装配该多肽蛋白所需的所有多肽的克隆细胞系。作为一个替代方法制备编码烸种多肽亚基的独立的载体构成物。使用每个这些载体产生单独的仅表达其中一个必需多肽的转基因植物的克隆系。然后使这些基因組植物杂交，创造在单个植林中表达所有必需多肽的子代参见Hiatt等，(1989)A^we342:76;Hiatt等的美国专利第5,202,422号和第5,639,947号该方法的一个变化形式是制备单个的基因構成物，将来自这些构成物的DNA混合在一起然后，采用弹道轰击或农杆菌介导的转化最好采用弹道轰击，将该DNA混合物传递入植物细胞中作为再一变化形式，某些或所有所述载体可以编码多于一个的该多体蛋白的亚基(即杂交浮萍克隆数少于该多体蛋白亚基数)最后，在某些情况下可能最好在一种转化的浮萍植林中产生少于多体蛋白的全部亚基，或甚至产生单一的蛋白例如用于工业生产或化学生产或用於诊断、治疗或疫苗目的。A.表达盒按照本发明待转移的核酸包含于表达盒内。该表达盒包含一个连接至目的核酸或基因的转录起始区這种表达盒提供有多个限制性位点，用于插入在调节区的转录调节下控制的一个或多个目的基因(例如一个目的基因两个目的基因等)。最恏是该表达盒编码单个目的基因。在本发明的具体实施方案中待转移的核酸含有两个或两个以上的表达盒，每个表达盒编码至少一个目的基因(最好是一个目的基因)该转录起始区(例如启动子)对于该宿主可以是天然的或同源的或为外来的或异源的。外来的是指在引入该转錄起始区的野生型宿主中没有发现该转录起始区本文使用的"嵌合基因"包括操作细菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳动物和植物的启动子)。优選植物启动子最优选浮萍的启动子。典型的启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒35S启动子、冠瘿碱合成酶启动子(例如nos、mas、ocs等)、遍在蛋白启動子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸(RubP)羧化酶小亚基启动子和醇脱氢酶启动子浮萍的RubP羧化酶小亚基启动子是本领域已知的。Silverthrone等(1990)尸/"WMo/.jB/o/.15:49。来洎感染植物(最好是浮萍)的病毒的其它启动子也是合适的包括但不限于从以下病毒分离出的启动子芋花叶病毒、小球藻病毒(例如小球藻腺噪呤曱基转移酶启动子；Mitra等，(1994)尸/a"fMo/ecw/w5/o/ogy26:85)、番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、烟草坏死病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、黄瓜花叶病毒、花生stump病蝳、亚麻花叶病毒等最后，可以选择启动子以给出所需水平的调节。例如在某些情况下，可能最好使用赋予组成型表达的启动子(例洳遍在蛋白启动子、RubP羧化酶基因家族启动子和肌动蛋白基因家族启动子)或者，在其它情况下可能最好使用对特定环境刺激(例如热激基洇启动子、干旱诱导型基因启动子、病原体诱导型基因启动子、剂(例如来自由脱落酸、生长素、细胞分裂素和赤霉酸诱导的启动子)应答时被激活的启动子。作为再一选择方法可以选择给出组织特异性表达的启动子(例如根、叶和花特异性启动子)。转录盒以5-3，转录方向包括┅个转录和翻译起始区、一个目的核苷酸序列和一个在植物中有功能的转录和翻译终止区本领域已知的任何合适的终止序列均可以按照夲发明使用。终止区对于转录起始区可以是天然的可以对于目的核苷酸序列是天然的，或可以得自另一来源方便的终止区可得自根癌農杆菌的Ti质粒，诸如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶的终止区也参见Guerineau等，Mo/.262141(1991);Pro函ot，CW/64,671(1991);Sanfacon等Dev.5，141(1991);Mogen等,尸taCe〃2,);Munroe等91，151(19卯)；Ballas等7Vwc/e/c爿cz.^s17,);和Joshi等，A^c/^c爿c/A15)。其它典型的終止序列是豌豆RubP羧化酶小亚基终止序列和花椰菜花叶病毒35S终止序列其它合适的终止序列对于本领域技术人员是显而易见的。或者可以茬本领域已知的任何其它合适的表达盒上提供目的基因。合适时为在转化的植物中增强表达，可以优化所述基因当在本发明中使用哺乳动物、酵母或细菌或双子叶植物基因时，可以采用单子叶植物或浮萍的优选密码子合成这些基因以增强表达。在本领域中可得到合成植物优选基因的方法参见例如美国专利第5,380,831号；第5,436,391号；和Murray等，iVwc/efc^"Ws17,477(1989);这些文献通过引用结合到本文中该表达盒可以还含有5'前导序列。这类前导序列可以作用以增强翻译翻译前导序列是本领域已知的，包括小核糖核酸病毒前导序列例如EMCV前导序列(脑炎心肌炎病毒5'非编码区；Elroy國Stein等，尸roc.A^/.^cadC/5^,86,));马铃薯Y病毒前导序列例如TEV前导序列(烟草蚀紋病毒；Alloson等,Wn/ogy,154，9(1986));人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP;Macajak和SarnowiVWwe353，90(1991));来自亚麻花叶病毒的包膜蛋白mRNA的非翻译湔导序列(AMVRNA4;Jobling和GehrkeA^/wm325,622(1987));烟草花叶病毒前导序列(TMV;Gallie,MOLECULARBIOLOGYOFRNA,237-56(1989));和玉米缺绿病斑点病毒前导序列(MCMV;Lommel等，Fz>o/ogy81382(1991))。也参见Della-Cippa等P/a"fP/^!'o/ogv84,965(1987)。已知增强翻译的其它方法也可以利用例如内含子等。可以将目的外源核酸另外与编码转运肽的核酸序列操作性地连接所述转运肽将所编码的目的肽或蛋白的表达导向特定的细胞区室。将高级植物细胞中蛋白积累导向叶绿体、线粒体、液泡、核和内质网(用于分泌到细胞外)的转运肽是本领域已知的最好是，该转运肽將由外源核酸表达的蛋白导向叶绿体或内质网对于分泌蛋白的正确加工，需要将蛋白导向内质网的转运肽将蛋白表达导向叶绿体(例如采用来自RubP羧化酶小亚基基因的转运肽)，已经表明导致在该细胞器中非常高浓度的重组蛋白的积累已经克隆了编码RubP羧化酶转运肽的浮萍核酸。Stiekma等(1983)Wwc/.M11:8051-61;也参见例如Herrera-Estrella等的美国专利第5,717,084号和第5,728,925号。已经用豌豆RubP羧化酶小亚基转运肽序列在植物中表达哺乳动物基因并将其定向。Herrera-Estrella等的美国專利第5,717,084号和5,728,925号或者，可以用哺乳动物转运肽将重组蛋白表达导向例如线粒体和内质网已经证明，植物细胞识别哺乳动物导向内质网的轉运肽Hiatt等的美国专利第5,202,422号和第5，639947号。该表达盒可以含有一个以上的待转移并在转化植物中表达的基因或核酸序列因此，每种核酸序列将与5和3，调节序列操作性地连接或者，可以提供多个表达盒一般而言，该表达盒将奖包含一个用于选择转化细胞的选择标记基因选择标记基因用来选择转化的细胞或组织。选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因诸如编码新霉素磷酸转移酶nc/v五o)和潮霉素磷酸转移酶(/7户7)的基因以及赋予对除草剂化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码经修饰的对该除草剂不敏感的靶蛋白或编码将在植物中在该除草剂作用之前将其降解或解毒的酶。参见DeBlock等五iWSO乂6，);DeBlock等P/aW尸/7"/0/.91，691(1989);Fromm等B/orec/mo/ogy8,833(19卯);Gordon-Kamm等，尸/a"fCe〃2603(1990)。例如采用编码突变輩巴酶5，-烯醇丙酮酰(enolpyuvyl)莽草酸-3-磷酸匼酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因已经获得的对glyphosphate或磺酰脲除草剂的抗性。采用编码将相应除草剂解毒的膦丝菌素乙酰转移酶、腈水解酶或2,4-二氯苯氧基乙酸单加氧酶的细菌基因已经获得了对草铵膦(glufosinateammonium)、溴苯腈(boromoxynil)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性对于本发明的目的，选择标记基因包括但不限于编码以下的基因新霉素磷酸转移酶II(Fraley等C7CCW"ca/WeWevw/"P/a"f5Wewce4，1(1986));氨基氰水合酶(Maier-Greiner等iVoc.Wa".爿cac/.C/SJ88,));天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶(Perl等，B/orec/wo/ogv11715(1993》;6w基因(Toki等，户/a"f尸—》/100,);Meagher等Oop36，));銫氨酸脱羧酶(Goddijn等_P/a"fAfo/.B/o/.22,907(1993));新霉素磷酸转移酶(A^(9;Southern等，乂Mo/.1327(1982));潮霉素磷酸转移酶(/fPr或/frG;Shimizu等，Mo/.CW/.6,));二氢叶酸还原酶(DHFR;Kwok等iVw/.爿cadScz'.(7&4vol,));膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock等，));22-二氯丙酸脱卣素酶(Buchanan-Wollatron等，丄Ce//.历oc/zem.13D330(1989));乙酰羟酸合酶(Anderson等的美国专利第4,761,373号；Haughn等，Mo/.Ge"".221266(1988));5-烯醇丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(araA;Comai等，A^wre317741(1985));卣代芳基腈水解酶(Stalker等的WO87/04181);乙酰辅酶A羧化酶(Parker等，尸/a"fPw'o/.92));②氢蝶酸合酶(w/I;Guerineau等，Mo/.15,127(1990));和32kDa光合系统II多肽(p赢;Hirschberg等S"'e"ce222，))也包括编码的对以下物质抗性的基因氯霉素(Herrera-Estrella等，五M50/2987(1983));氨曱蝶呤(Herrera-Estrella等，7W^w^3);Meijer等户/滅Mo/.編.16,807(1991));潮霉素(Waldron等，J3/""^Mo/.所o/.5,103(1985);Zhijian等户/a"f5We"ce108,219(1995);Meijer等，户taMo/.历o.16,807(1991));链霉素(Jones等Mo/.Ge".Gew"210,86(1987));壮观霉素(Bretagne-Sagnard等，rraragem'c及w.5,131(1996));博来霉素(Hille等尸/awfMo/.7,171(1986));氨磺酰(Guerineau等，户/a"/Mo/.组15127(1990);溴苯腈(Stalker等，5We騰242419(1988));2，4-D(Streber等所o/rec/mo/ogy7,811(1989));膦丝菌素(DeBlock等，皿BO./6));壮观霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau,Thmsgem,ci^earc/z5，131(1996》6"r基因赋予对草铵膦型除草剂的除草剂抗性，所述除草剂诸如膦丝菌素(PPT)或双丙氨膦等如上所述，可以用于载体构成物中的其它选择标记包括但不限于也赋予双丙氨膦和膦丝菌素抗性的p^基因、赋予咪唑啉酮抗性的^LS基因、赋予潮霉素抗性的//尸/f或/n^基因、赋予草甘膦抗性的EPSP合酶基洇、赋予对Hc-毒素抗性的Hml基因和本领域常规使用和已知的其它选择剂一般参见Yarranton,C脏.Qp/w.肠&c/z.3,506(1992);Chistopherson等，尸亂扁.Sc/.园89);Yao等，Ce〃71,63(1992);Reznikoff,Mo/.M/craWo/.6,);BARKLEY等,THEOPERON177-220(1980);Hu等CW/48，555(1987);Brown等Ce〃49,603(1987);Figge等，Ce〃52,713(1988);Deuschle等尸亂胸/.y4cW.园86,);Fuerst等，iVoc.胸/.5W."5^486,);Deuschle等<Sc/e"ce248,480(1990);Labow等Afo/.Ce//.5/o/,10，);Zambretti等iVoc.iVa"Jcadt/&489,);Baim等，A^/.^ca^.5W.88);Wyborski等，M/c.^"V/sM19);Hillenand-Wissman,Ibp/csM/Jmsf6Vrwc.10,143(1989);Degenkolb等，Jwf/m/cro6.CTzemof/zer.35,);Kleinschnidt等,5/oc/z麵勿27);Gatz等,尸/aWJ2，397(1992);Gossen等尸亂淑/,JcW.,89，);Oliva等爿""m/cra6.C/^moAer.36，913(1992);HLAVKA等HANDBOOKOFEXPERIMENTALPHARMACOLOGY78(1985);和Gill等iVWwM334，721(1988)这类说明书通过引用结合到本文中。以上列出的选择标记基因不意味着为限制性的任何选择标记基因均可以用于本发明中。合适时可以合成选择标记基因和其它待转移的目的基因和核酸，以优化在浮萍中的表达也就是说，可以修饰所述基因的编码序列以增强在浮萍中的表达。设计合成的核酸以在转化组織和植物中较高水平地表达。优化的选择标记基因的使用可能导致较高的转化效率本领域中可得到基因合成优化的方法。可以优化核苷酸序列以在浮萍中表达，或者可以将其修饰以优化在单子叶植物中的表达。可以根据在浮萍中表达的蛋白中的最高频率的密码子确萣植物的优选密码子。人们认识到已经优化用于浮萍和其它单子叶植物中表达的基因可以用于本发明方法中。参见例如EP0359472、EP0385962、WO91/16432;Perlak等Proc.胸/.颠d5W.固88，)和Murray等Wwc.Jc/A17,477(1989)等，所述文献通过引用结合到本文中人们还认识到，可以优化或合成该基因序列的全部或部分换句话说，也可以采用全优化嘚或部分优化的序列已知其它序列修饰增强在细胞宿主中的表达。这些序列修饰包括消除编码假的多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含孓剪接位点信号、转座子样重复序列和其它这类充分特征鉴定的、可能对基因表达有害的序列可以将该序列的G-C含量调节至给定细胞宿主嘚平均水平，该水平根据在该宿主细胞中表达的已知基因计算可能时，修饰该序列以避免预定的发夹二级mRNA结构。B.把组织和愈伤组织本發明的方法可用来转化浮萍植林的细胞最好是叶细胞和分生细胞。这类细胞也包括来源于浮萍植抹的任何组织的愈伤组织用于起始愈傷组织的组织最好是分生组织。或者该愈伤组织可以来源于任何其它叶细胞，或主要来源于能够形成愈伤组织的任何其它浮萍组织换呴话说，能够进行后续克隆繁殖的任何组织无论它是通过器官发生还是胚胎发生进行克隆繁殖，均可以用来按照本发明转化浮萍本文所用的术语"器官发生"是指由分生中心(meristematiccenter)顺序发育叶和根的过程。本文所用的术语"胚胎发生，是指叶和根一起以协同方式(不是顺序地)发育無论它来自体细胞还是来自配子。该方法也可以用来转化细胞悬液这类细胞悬液可以由任何浮萍组织形成。所述浮萍产生三类愈伤组织(a)致密的半组构化(organized)的愈伤组织(命名为I型)；(b)脆性的白色未分化愈伤组织(命名为II型)；和(c)绿色的分化的愈伤组织(命名为m型)在组织培养中，愈伤组織仅以两种方式再生植株通过胚胎和通过苗形成(在浮萍中叶是苗)。愈伤组织诱导的方法是本领域已知的对于每个浮萍物种和所需类型嘚愈伤组织，可以优化待使用的具体条件如在以下实施例中证明的。最好使用I型或III型愈伤组织更优选使用I型愈伤组织，以按照本发明轉化浮萍通过在含有植物生长调节剂(即细胞分裂素和生长素)的培养基中培养浮萍组织，可以诱导愈伤组织优选用于从浮萍组织诱导愈傷组织的生长素包括2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和萘乙酸(NAA)。优选的生长素浓度为1-30|LiM,更优选为5-20|aM再更优选为5-10pM。优选的细胞分裂素是节基腺噪呤(BA)或噻苯隆(TDZ)優选的细胞分裂素的浓度为0.1-10iliM，更优选为0.5-5(iM再更优选为0.5-1pM。在其它更优选的实施方案中通过在含有BA或TDZ之一和或者2,4-D或NAA之一的培养基中培养浮萍組织，诱导愈伤组织一般而言，低浓度的生长素或"弱"生长素(例如叼l哚乙酸)促进叶的增殖而非愈伤组织的形成，而高浓度的生长素或"强"苼长素(例如2,4-D)促进愈伤组织形成优选的愈伤组织形成基础培养基包括N6培养基(Chu等，Sc/ew"aS/m'ca18,659(1975))和Murashige和Skoog培养基(Murashige和Skoog尸/^w'o/.尸/a"A15,473(1962))，更优选Mumshige和Skoog培养基一般而言，愈伤組织诱导的频率是可变的在这些物种中，培养2-3周时肉眼看不到愈伤组织在愈伤组织的大小足以用于转化之前，可能需要4-8周的培养愈傷组织的诱导最好进行1-10周，更优选进行2-8周再更优选进行3-5周。对于愈伤组织的生长优选的培养基如同用于愈伤组织诱导的培养基，但生長素的浓度降低C.通过弹道攻击转化浮萍本发明的一个实施方案是用目的核苷酸序列转化浮萍，其中该核苷酸序列含有至少一个表达盒所述表达盒携带赋予对选择剂抗性的基因。该核苷酸序列由微弹携带就本发明人所知，先前没有报道通过弹道转化产生稳定转化的浮萍。按照本发明的优选实施方案该弹道转化法包括以下步骤(a)提供作为靶的浮萍组织；(b)以足以穿刺该组织内细胞的细胞壁并将该核苷酸序列沉积在该组织细胞内的速率，将携带该核苷酸序列的微弹发射到该浮萍组织藉此提供转化的组织。在本发明的具体实施方案中该方法还包括用选择剂培养转化的组织，如下所述在再一可选择的实施方案中，进行选择步骤后进行从该转化组织再生转化浮萍的步骤。洳下所述该技术可以用作为单独的沉淀(湿或冻干)的核苷酸序列实施，以取代含有该核苷酸序列的水溶液任何弹道细胞转化装置均可以鼡于实施本发明。Sandford等(尸aWcw/她5Wewcerec/mo/ogy5,27(1988》、Klein等(iV齒re32770(1987))和在EP0270356中公开了典型的装置。这类装置已经用来转化玉米细胞(Klein等iVw/.爿c^/.5W.f/5^85,))、大豆愈伤组织(Christou等，尸to尸—/.87,671(1988)、McCabe等，万/rec/mo/ogy6，923(1988))、酵母线粒体(Johnston等Sc/e"ce240，))和衣藻属(C7z/aw;^omo"as)叶绿体(Boynton等5We"ce240,))。在本文提出的研究中使用DuPont生产的市售氦基因枪(PDS-100/He)。或者可以利用如Klein等描述配置的装置(A^w"70:327(1987))。该装置包括一个轰击室该轰击室被高度可调的终止板(stoppingplate)分为两个独立的区室，加速室安装于轰击室的上面宏观弹因枪粉电荷而被沿著加速室发射到终止板。终止板中有一形成的镗孔(borehole)其直径小于微弹的直径。宏观弹(macroprojectile)携带微弹将宏观弹瞄准镗孔，并对着镗孔射出当宏观弹被终止板终止时，微弹通过镗孔发射将靶组织定位在轰击室中，使得通过镗孔发射的微弹透过靶组织细胞的细胞壁并将其上携帶的目的核苦酸序列沉积在靶组织细胞中。轰击室在使用之前部分抽空以防止大气摩擦力减慢微弹。该室仅被部分抽空使得耙组织在轟击期间不被干燥。约400至约800毫米汞的真空是合适的在可选择的实施方案中，不用微弹而达到弹道转化例如，可以由宏观弹携带含有作為沉淀的目的核苷酸序列的水溶液(例如通过将水溶液直接置于宏观弹的板接触端而不用微弹，其中通过表面张力保持水溶液)将该溶液單独发射到植物组织靶上(例如通过将宏观弹以上述相同方式沿加速管发射)。其它方法包括将该核酸沉淀本身("湿"沉淀)或冷冻干燥的核苷酸沉澱直接置于宏观弹的板接触端而不用微弹。在没有微弹时据信该核苷酸序列必须或者以大于由微弹携带所需的速度发射到组织靶上，戓者使得该核苷酸序列移动较短的距离而到达靶组织(或这两者)目前最好是在微弹上携带该核苷酸序列。已知该粒子的速度和该粒子必须迻动的距离所以可以由具有足够密度和粘结性的任何材料形成微弹，以发射透过细胞壁用于制造微弹的材料的非限制性实例包括金属、玻璃、二氧化硅、冰、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和碳化合物(例如石墨、钻石)。目前优选金属粒子合适金属的非限制性实例包括钨、金和铱。粒子的大小应该足够小以避免过度破坏它们在靶组织中接触到的细胞，而粒子的大小应该足够大以提供透过靶组织中目的细胞所需的惯性。直径范围为约0.5微米至约3微米的粒子是合适的粒子不必是球形，因为粒子表面不规则可以增加其DNA的容纳量可以通过沉淀將该核苷酸序列固定在该粒子上。所用的精确的沉淀参数如本领域已知的将根据诸如所用的粒子加速方法而变化。载体粒子可以可任选哋用诸如聚赖氨酸的包嚢剂包被以提高固定其上的核苷酸序列的稳定性，如在EP0270356(第8栏)中所述在弹道轰击靶组织后，如以下E小节所述可以選择转化子和再生转化的浮萍植林D.农杆菌介导的转化在本发明的一个实施方案中，用根癌农杆菌或毛根农杆菌最好用根癌农杆菌，转囮浮萍农杆菌介导的基因转移利用根癌农杆菌或毛根农杆菌将DNA转移入植物染色体中的天然能力。农杆菌是植物病原体它将分别在根癌農杆菌或毛根农杆菌的Ti质粒和Ri质粒中称为T-DNA的区内编码的一组基因转移入植物细胞中。Ti质粒转移的典型结果是称为根癌的肿瘤生长其中T-DNA稳萣整合入宿主染色体中。Ri质粒整合入宿主染色体DNA,产生称为"发根病"的疾病通过在T-DNA中取出该基因，而不丧失DNA转移和整合可以除去在宿主植粅中引起疾病的能力。将待转移的DNA连接至限定整合的T-DNA终点的边界序列利用工程改造的农杆菌菌林进行的基因转移，已经成为许多双子叶莋物的常规技术然而，在使用农杆菌转化单子叶植物中特别是在谷类植物中，已经经历了相当大的困难就本发明人所知，迄今没有報道利用农杆菌介导的转化产生稳定转化的浮萍尽管以下的讨论集中于使用根癌农杆菌以达到浮萍中的基因转移，但本领域技术人员会認识到这一讨论同样适用于毛根农杆菌。与根癌农杆菌的开发相似已经开发了用毛根农杆菌的转化，并且已经成功地用来转化例如亚麻、龙葵(So/a"wmm'gram丄.)和白杨Ryals等的美国专利第5，777200号。如Burgess等的美国专利第5773，693号所述最好使用解除武装的根癌农杆菌菌林(如下所述)，然而可以使用野生型毛根农杆菌。一个说明性的毛根农杆菌的菌林是菌抹15834修饰用于本发明方法中的农杆菌菌抹，以使其含有一种或多种目的基因、或在转化细胞中待表达的核酸将待转移的核酸加入T区，其侧翼为T-DNA边界序列本领域已知多种农杆菌菌株，特别是用于双子叶植物转化嘚菌林这种农杆菌可以用于本发明方法中。参见例如Hooykass,尸/a"fMo/.历o/.13327(1989);Smith等，CVo/Sc/ewce35301(1995);Chilton,iW^/.Jcad<Sc/.[75^490，);Mollony等Afo打ogra;/z77zeor.^pp/.GewefA^"19，148(1993);Ishida等iV^we所o&c/z"o/.14，745(1996);和Komari等,r/2e尸/a"^Jow7^/10165(1996)，这些文献的说明书通过引用结合到本攵中除T区外，Ti(或Ri)质粒还含有一个Wr区Wr区对于有效的转化的重要的，并且看来是物种特异性的已经开发了双载体系统，其中受操作的解除武装、携带外源DNA的T-DNA和v/r功能存在于不同的质粒上以该方式，在一个在大肠杆菌中复制的小质粒中构建包含外源DNA(待转移的核酸)的修饰的T-DNA區。该质粒以三亲本交配接合转移或通过电穿孔转移入含有毒性基因序列的匹配质粒的根癌农杆菌中。v^功能以反式供应以将T-DNA转移入植粅基因组中。这类双载体可用来实施本发明在本发明的优选实施方案中，C58衍生载体用来转化根癌农杆菌或者在其它实施方案中，使用超双载体参见例如美国专利第5,591,615号和EP0604662，它们通过引用结合到本文中已经构建了这种超双载体，它含有来源于Ti质粒pTiBo542的超毒性区的DNA区(Jin等乂B她no/.169，)),所述Ti质粒是表现出极其高转化效率的超毒性根癌农杆菌A281中含有的(Hood等,所她c/mo/.2,702(1984);Hood等/.S論Wo/.168，);IComari等Ba"eWo/.166,88(1986);Jin等，j5ac&n'o/.169,);KomariS/c騰e60,223(1987);ATCC保藏号为37394。本领域技术人员已知的典型超双载体包括pTOK162(日本专利申请(Kokai)第4-222527号、EP504,869、EP604,662和美国专利第5,591,616号这些文献通过引用结合到本文中)和pTOK233(Komari,尸taCW/鄉o他9，303(1990);Ishida等淑,5/o&c/mo/ogyl4，745(1996);这些文献通过引用结合到本文Φ)可以用以上文献中提出的方法构建其它超双载体。超双载体pTOK162能够在大肠杆菌和根癌农杆菌中复制另外，该载体含有来自pTiBo542孑曼入区(virulenceregion)的vz>B、vz>C和v/K5基因i亥质粒也含有一个抗生素抗性基因、一个选择标记基因和待转化入该植物的目的核酸。待插入浮萍基因组的核酸位于T区两个边堺序列之间可以构建具有pTOK162上述特征的本发明的超双载体。构建所述超双载体和用于本发明的其它载体的T区以具有插入待传递的基因的限制性位点。或者通过利用体内同源重组，可以将待转化的DNA插入该载体的T-DNA区参见Herrera-Esterella等，乂2,987(1983);Horch等5We"ce223,496(1984)。这种同源重组依赖于这样一个事实该超雙载体具有一个与pBR322或其它相似质粒一个区同源的区因此，当两种质粒在一起时所需基因通过同源区的遗传重组，插入该超双载体任哬适用于转化浮萍的载体均可以按照本发明使用。例如可以由缺乏v!>区的双载体携带异源目的核酸序列和侧翼的T-DNA。然后在解除武装的Ti质粒或在第二双质粒上提供v/r区。作为另一选择方法通过新T-DNA取代原始Ti质粒T-DNA的双重组事件，可以将异源核酸序列和T-DNA边界序列置于Ti质粒的T-DNA位点w>區可以由该Ti质粒供应，或在一个双质粒上供应作为再一选择方法，可以如Schilperoort等的美国专利第4,940,838号所述将异源核酸序列和侧翼的T-DNA整合入细菌染色体中，v/r区则可以在一个Ti质粒或一个双质粒上供应本发明的农杆菌介导的转化法可以被认为包括几个步骤。基本步骤包括感染步骤和協同培养步骤在某些实施方案中，在这些步骤后进行一个选择步骤在其它实施方案中，在这些步骤后进行一个选择和一个再生步骤茬感染步骤之前，可以包括一个可选的预培养步骤该预培养步骤包括在感染步骤之前，在合适的培养基中培养愈伤组织、叶或其它耙组織预培养的时间可以为约1-21天不等，最好为7-14天发现这种预培养步骤防止玉米培养物转化。参见例如EP0672752在感染步骤中，使待转化的细胞暴露于农杆菌将细胞与农杆菌接触，通常在液体培养基中接触如上所述，该农杆菌已被修饰以含有一个目的基因或核酸将该核酸插入該载体的T-DNA区。本领域技术人员熟知用于本发明的一般分子生物学技术参见例如SAMBROOKL等，MOLECULARCLONGING:ALABORATORYMANUAL(1989)含有目的质粒的农杆菌最好在农杆菌主平板上维持，于约-80C冷冻贮存。主平板可以用来接种琼脂平板以获得农杆菌，然后将农杆菌悬浮于培养基中用于感染过程。或者在转化之前，來自主平板的细菌可以用来接种液体培养物该液体培养物在转化之前生长至对数期。用于感染步骤和协同培养步骤的农杆菌的浓度可鉯影响转化效率。同样非常高浓度的农杆菌可能损害待转化组织，并导致愈伤组织应答降低因此，用于本发明方法中的农杆菌的浓度可以根据所用的农杆菌菌林、待转化的组织、待转化的浮萍物种等而变化。为了优化具体浮萍物种或组织的转化方案可以用不同浓度嘚农杆菌接种待转化的组织。同样可以评估各种农杆菌浓度的标记基因表达的水平和转化效率。尽管农杆菌的浓度可以变化但一般使鼡的浓度范围为约1x103cfu/ml至约1x101Gcfb/ml，范围优选为1xio3cfu/ml至约1x109cfu/ml再更优选利用约1x108cfu/ml至约1x109cfu/ml。一般将待转化组织加入液体接触相的农杆菌悬液中该悬液含有优化转囮效率的浓度的农杆菌。该接触相促进使待转化组织与农杆菌悬液的最大接触一般在协同培养步骤之前，让感染进行1-30分钟优选进行l-20分鍾，更优选进行2-10分钟再更优选进行3-5分钟。本领域技术人员会认识到可以优化所述条件，以达到最高水平的农杆菌感染和转化例如，茬本发明的优选实施方案中在感染和协同培养步骤期间，使细胞经受渗透压(例如0.6M甘露醇)另外，为了提高转化效率可以在含有生长素(諸如IAA)的培养基中培养组织，以促进细胞增殖(即人们认为农杆菌在有丝分裂期间整合入基因组中)。作为再一选择方法可以使用组织创伤、真空压力或在含有乙酰丁香酮的培养基中培养，以提高转化效率在协同培养步骤中，将待转化的细胞与农杆菌协同培养通常，协同培养在固体培养基上进行可以使用任何合适的培养基，诸如含有1%蔗糖和0.6°/琼脂的Schenk和Hildebrandt培养基(Schenk和Hildebrandt,Ca"./5oA50,199(1972))。最佳协同培养时间随具体的组织而变化叶与农杆菌协同培养约2-7天，优选2-5天更优选3-5天，更优选4天相比之下，愈伤组织与农杆菌协同培养0.5-4天更优选l-3天，更优选2天可以在黑暗中或在减弱的光照条件下进行协同培养，以提高转化效率另外，如以上接种步骤所述可以在含有IAA或乙酰丁香酮的培养基上进行协同培养，以提高转化效率最后，在细胞分裂素存在下进行协同培养步骤细胞分裂素用来增强细胞增殖。在协同培养步骤后可以使转化嘚组织经过可选的静息和去污染步骤。对于静息/去污染步骤将转化细胞转移至含有能够抑制农杆菌生长的抗生素的第二培养基上。在缺乏任何选择压力的情况下进行该静息期以允许含有该异源核酸的转化细胞恢复和增殖。加入抗生素以抑制农杆菌的生长这类抑制农杆菌的抗生素是本领域已知的，包括头孢噻肟、timetin、万古霉素、羧节青霉素等抗生素的浓度将根据每种抗生素的标准而变化。例如在固体培养基中，羧千青霉素的浓度范围为约50mg/1至约250mg/1优选约75mg/1至源200mg/1,更优选约100-125mg/1。单子叶植物转化领域的技术人员会认识到对于特定的转化方案可以優化抗生素的浓度，而不用过多的试验优选让静息期培养物在黑暗或在减弱的光下静息，最好在减弱的光下静息本领域已知的任何培養基均可以用于静息期。静息/去污染步骤进行的时间可以是抑制农杆菌生长并在选择之前提高转化细胞数目所需的时间长度通常，在选擇步骤之前静息/去污染步骤进行1-6周，优选2-4周更优选2-3周。在更优选的实施方案中选择时间在协同培养后的3周内开始。某些农杆菌菌林嘚抗生素抗性强于其它菌林对于抗性较低的菌林，通常通过每5天等将新的去污染培养基加入愈伤组织中进行去污染。对于抗性较强的菌抹可以每隔一天将较强的抗生素(例如万古霉素)加入愈伤组织中。在协同培养步骤或静息/去污染步骤后可以按以下E小节中所述选择转囮子并再生浮萍植林。E.转化子的选择和转化浮萍植抹的再生按照本发明转化浮萍组织或愈伤组织例如通过弹道轰击或农杆菌介导的转化來进行转化，每种方法分别在C和D小节中更详细地描述转化步骤后，将转化组织暴露于选择压力以选择那些接受来自表达盒引入的异源核酸并正在表达该核酸编码的多肽的细胞。根据含有至少一个选择标记插入片段的细胞的优先生长选择用来选择转化子的试剂，所述选擇标记插入片段位于表达盒内并通过弹道轰击或农杆菌传递一般而言，进行选择转化子(来自任何组织类型或愈伤组织)的条件是本文公开嘚方法的最重要的方面转化过程使细胞经受胁迫，而选择过程甚至对转化子有毒通常，针对这种顾虑转化组织最初经受弱选择，利鼡低浓度的选择剂和减弱的光(例如1-5pmol/m、sec通过提高该选择剂的浓度和/或提高光强，以应用的选择梯度逐渐增加)如果该组织看上去经受胁迫，则可以完全解除选择压力一段时间然后重新施加选择压力。另外可以给予转化的组织一段"静息"时间，如以上在D小节中所述然后再嫃正施加任何选择压力。选择培养基一般含有简单的糖诸如1%-3%的蔗糖，使得细胞不进行光合作用另外，最初在减弱的光条件下进行选择或甚至在完全黑暗中进行选择，以便将细胞的代谢活性保持在相对低的水平本领域技术人员会认识到，对于每种浮萍物种或品系和对於待转化的组织类型可以优化进行选择的具体条件，而不用过多的试验对于选择步骤没有具体的时间限制。一般而言进行选择的时間长度足以杀伤非转化子，并允许转化细胞以类似于非转化细胞的速率进行增殖以在再生步骤之前产生足够的愈伤组织(callul)块。因此对于鉯较慢速率增殖的细胞，选择的时间较长例如，I型浮萍愈伤组织增殖相对緩慢在再生之前进行8-10周的选择。从转化细胞和愈伤组织再生某些植抹的方法是本领域已知的参见例如Kamo等，5of.146,37(1985);West等7TzeP/a"fCW/5，);和Duncan等尸/a齒165，322(1985)对于再生浮萍，推荐几种这些方法的改进方法用i型和m型愈伤组织，可以最可靠地获得转化和选择后的叶再生例如，可以根据淡黄色愈伤组织表面上出现的绿色中心(形成叶的位点)鉴别i型愈伤组织的再苼。通常在支持愈伤组织增殖的相同培养基条件下不发生浮萍的再生。最好使用贫乏的固体培养基(leansolidmedium)(例如水-琼脂或半强度Schenk和Hildebrandt培养基(含有0.5%蔗糖和0.8%琼脂))然而，通常需要在全强度培养基上间断地短期培养再生浮萍愈伤组织以维持再生细胞中的营养平衡。在某些情况下对于緩慢再生的品系或物种，在叶再生之前该方法可能必须重复数次。通常不在叶再生培养基中加入植物生长调节剂(因为它们抑制叶的形成)，然而诸如BA和硫酸腺嘌呤的细胞分裂素，对于某些物种而言可以提高叶的再生愈伤组织培养物在延长的愈伤组织培养期间不丧失其再苼叶的能力。在再生过程中本领域已知的任何方法均可以用来证实再生的植株事实上是用所转移的目的核酸转化的。例如组织化学染銫、ELISA测定、DNA杂交、RNA杂交、蛋白质杂交、PCR等可以用来检测愈伤组织和再生抹中所转移的核酸或蛋白。由于已经证明浮萍可以用弹道轰击和农杆菌转化因此可以使用对本文所述通用方法的改变方法，以提高效率或以转化对转化可能表现出一定抗拒的品系。影响转化效率的因素包括浮萍的物种、感染的组织、组织培养的培养基的组成、选择标记基因、任何上述步骤的时间长度、载体的种类和光/黑暗条件具体對于农杆菌介导的转化，根癌农杆菌或毛根农杆菌的浓度和菌林也必须考虑因此，可以改变这些因素和其它因素以确定任何特定浮萍粅种或品系的最佳转化方案。人们会认识到不是每个物种和品系都对转化条件有同样反应，对于本文公开的方案可能需要略微不同的修妀然而，通过改变每个变量对于任何浮萍系均可以得到最佳方案。提供以下实施例是为了进行说明而不是为了限制。实施例中所用嘚"hr，是指小时"sec"是指秒，"g，是指克"mg"是指毫克，'T是指升，'T是指毫升，"mmol"是指毫摩尔"mM"是指毫摩尔浓度，"|LiM"是指微摩尔浓度"m，是指米，"mm"是指毫米"BA"是指千基腺嘌呤，"24-D"是指2，4-二氯苯氧基乙酸"NAA"是指萘乙酸，而"IAA"是指吲咮乙酸实施例组织培养该小节提出涉及浮萍愈伤组織制备方法的实验。许多实施例使用丄em加gA6aG3作为浮萍品系是用来优化培养参数的品系(1)基础培养基的配制，(2)植物生长调节剂的类型和浓度囷(3)转移方案。随着对愈伤组织形成的了解的增加这适用于其它浮萍物种。浮萍产生三种类型的愈伤组织(a)致密的半组构化愈伤组织(命名为I型)；(b)脆性的白色未分化的愈伤组织(命名为II型)；和(c)绿色的分化的愈伤组织(命名为III型)在组织培养中，愈伤组织仅以两种方式再生植抹通过胚胎和通过苗形成(在浮萍中叶是苗)。以下提出的数据证明可以从所有已知的愈伤组织再生叶的途径再生转化的浮萍植林。实施例1对于生長素24-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和细胞分裂素千基腺噤呤(BA)的18种组合，测试其对浮萍物种丄ew"ag^^G3中愈伤组织诱导的作用在实验之前，使浮萍叶在含有3%蔗糖的液体Hoagland培养基(Hoagland和SnyderiVoc.^證.Soc.Z/oW.30,288(1933》中于23。C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40|imol/m2"ec为了诱导愈伤组织，制备18等份含有3%蔗糖、0.15%Gelrite和0.4%Difco细菌培养用琼脂的100mlMurashige和Skoog基礎培养基其2,4-D的浓度为10、20和50nM,而BA的浓度为0、0.01、0.1、1.0、2.0和10.0nM。所有培养基的pH均调至5.8于121。C高压灭菌20分钟冷却，将每100ml注入4个100mmx15mm培养皿中使用3个2,4-D浓度x6個BA浓度的全阶乘实验设计(总共18种处理)，'每种处理有4个重复测定每个重复测定1个培养m,每个培养皿5片叶。为了诱导愈伤组织,将5个单独的浮萍葉背轴面向下置于每个培养基平板上将72个平板于23。C培养27天光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40pmol/m、sec27天后，将浮萍组织转移至相同类型的新鲜培養基再于相同的温度和光培养条件下继续培养35天。以愈伤组织诱导频率(制备任何愈伤组织的叶数/总叶数)测量的结果显示出培养62天后三种類型的愈伤组织增生(l)致密的白色-黄色愈伤组织鉴定并命名为"I型"。低频率的叶即约5%增生该类型的愈伤组织。(2)脆性的白色愈伤组织鉴定并命名为"II型"20-40%的叶增生该类型的愈伤组织。(3)以其细胞组构化程度归类的绿色的愈伤组织鉴定并命名为"m型"所有增生的50%以上的叶在培养期间产苼该愈伤组织类型。所有三种类型的愈伤组织均证明在所有18种2,4-D和BA的组合下以不同的频率增生。愈伤组织增生在20-50|LiM的范围广泛的24-D浓度和0.01-0.1|iiM的BA濃度内最强烈。实施例2测试生长素2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和细胞分裂素千基腺噪呤(BA)的40种浓度以更优化该生长素和细胞分裂素浓度，以由丄em"agz'^"G3的浮萍叶诱导愈伤组织在实验之前，使浮萍叶在含有3°/蔗糖的液体Hoagland培养基中于23。C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40lamol/m、sec为了诱导愈伤组織，制备40等份含有3%蔗糖、0.15%Gelrite和0.4%Difco细菌培养用琼脂的100mlMurashige和Skoog培养基其2，4-D的浓度为20、30、40、50、60、70、80、100|_iM,而BA的浓度为0.01、0.05、0.1、0.5和1.0nM所有培养基的pH均调至5.8,于121。C高壓灭菌20分钟冷却，将每100ml注入4个100mmx15mm培养皿中使用8个2，4-D浓度x5个BA浓度的全阶乘实验设计(总共40种处理)每种处理有4个重复测定，每个重复测定1个培养m,每个培养皿5片叶为了诱导愈伤组织，将5个单独的浮萍叶背轴面向下置于每个培养基平板上将平板于23。C培养27天光周期为16hr光/8hr黑暗，咣强约为40nmol/m、sec27天后，将浮萍组织转移至相同类型的新鲜培养基再于相同的温度和光培养条件下继续培养35天。培养63天后得到的结果表明巳经增生出三种类型的愈伤组织(l)I型愈伤组织，(2)11型愈伤组织和P)III型愈伤组织。数值频率数据(制备任何愈伤组织的叶数/总叶数)的回归分析(二次反应曲面)揭示出对于不同类型的愈伤组织诱导的叶反应II型和III型愈伤组织类型的频率显著受2，4-D和BA浓度的影响然而，I型愈伤组织的频率仅顯著受24-D的影响。没有具体的24-D或BA的浓度证明为最佳的，在范围广泛的两种植物生长调节剂的浓度下都发生愈伤组织诱导约50%的叶产生III型愈伤组织，约25%的叶产生II型愈伤组织而低于5%的叶产生I型愈伤组织。实施例3测试生长素麦草畏和细胞分裂素千基腺噪呤(BA)的40种组合以比较麦艹畏相对于2,4-D对于浮萍种丄emwagA^G3的愈伤组织诱导的相对效力。在实验之前使浮萍叶在含有3%蔗糖的液体Hoagland培养基中于23。C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，咣强约为40|timol/m2"ec为了诱导愈伤组织，制备40等份含有3%蔗糖、0.15%Gelrite和0.4%Difco细菌培养用琼脂的100mlMurashige和Skoog培养基其麦草畏的浓度为10、20、30、40、50、60、80、100pM,而BA的浓度为0.01、0.05、0.1、0.5囷1.0jxM。所有培养基的pH均调至5.8于121。C高压灭菌20分钟冷却，将每100ml注入4个100mmx15mm培养皿中使用8个麦草畏浓度x5个BA浓度的全阶乘实验设计(总共40种处理)，每種处理有4个重复测定每个重复测定1个培养亚，每个培养皿5片叶为了诱导愈伤组织，将5个单独的浮萍叶背轴面向下置于每个培养基平板仩将平板于23。C培养27天光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40pmol/m、sec28天后，将浮萍组织转移至相同类型的新鲜培养基再于相同的温度和光培养条件丅继续培养45天。培养73天后观察到三种类型的愈伤组织增生(l)I型愈伤组织，(2)1I型愈伤组织和(3)III型愈伤组织。总之愈伤组织的增生差，并在10和20iiM嘚麦草畏浓度上发生；高于30pM,不发生愈伤组织的增生II型和III型愈伤组织类型对麦草畏反应而增生；极少I型愈伤组织增生。实施例4使用两种浓喥的2,4-D结合BA以确定是否维持愈伤组织的生长，以及是否由以丄e附mg/MaG3观察到的三种类型建立愈伤组织系在实验之前，使浮萍叶在含有1%蔗糖的液体Schenk和Hildebrandt培养基(Schenk和Hildebrandt,Om./组50,199(1972))中于23C培养2周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40^imol/m2"ec。为了诱导愈伤组织制备含有3%蔗糖、0.15%Gelrite、0.4%Difco细菌培养用琼脂、0.01pMBA的400mlMumshige和Skoog培养基，其2,4-D嘚浓度为10和40|liM所有培养基的pH均调至5.8,于12rC高压灭菌20分钟，冷却将每200ml等份注入8个100mmx15mm培养皿中。使用2种处理的随机区组实验设计每种处理有4个重複测定，每个重复测定1个培养m,每个培养皿5片叶为了诱导愈伤组织，将5个单独的浮萍叶背轴面向下置于每个培养基平板上将这些平板于23。C培养27天光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40lumol/m、sec4周后，将浮萍组织转移至相同类型的新鲜培养基再于相同的温度和光培养条件下继续培养4周。培养8周后观察到三种类型的愈伤组织增生(l)I型愈伤组织，(2)1I型愈伤组织和(3)III型愈伤组织。将所有三种愈伤组织养基上在相同的培养条件丅继续培养4周以进行传代培养。培养2个月以上后在102,4-D和0.01pMBA上的I型和III型愈伤组织建立了健康的增殖愈伤组织培养物。II型愈伤组织没有增生尽管以4周的传代培养时间表可以维持愈伤组织的增生，但在传代培养期间的第三周和第四周期间注意到愈伤组织衰退。实施例5用丄em"agA6aG3测试维歭愈伤组织增生的传代培养时间表在实验之前，使浮萍叶在含有1%蔗糖的液体Schenk和Hildebrandt培养基中于23C培养2周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40|umol/m2"ec。为了誘导愈伤组织制备含有3%蔗糖、0.15%Gelrite和0.4%Difco细菌培养用琼脂、30(xM2，4-D和0.02BA的500mlMurashige和Skoog培养基将pH均调至5.8，于121°C高压灭菌30分钟冷却，注入20个100mmx15mm培养皿中使用2种处悝的随机区组实验设计，每种处理有2个重复测定每个重复测定5个培养JHL,每个培养JHL5片叶。为了诱导愈伤组织将5个单独的浮萍叶背轴面向下置于每个培养基平板上。将这些平板于23C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40pmol/m、sec2周后，将一半平板(IO个平板)上的浮萍组织转移至相同组成的噺鲜培养基再于同未转移组织相同的条件下继续培养。4周后评估该组织的愈伤组织增生。三种类型的愈伤组织增生I型愈伤组织、II型愈傷组织和III型愈伤组织与没有转移培养4周的浮萍组织相比，在2周时转移的浮萍组织之间没有观察到愈伤组织类型或增生的差异从原始叶傳代培养I型和III型愈伤组织，并在含有3%蔗糖、0.15%Gelrite、0.4%Difco细菌培养用琼脂、10|aM24國D和0.01一BA的Murashige和Skoog培养基中继续培养。将增生愈伤组织以2周的间隔继续传代培養至组成相同的新鲜培养基转移之间较长的间隔导致2-3周之间愈伤组织健康状况的突然衰退。当维持2周传代培养时间表时愈伤组织继续增生，而不丧失活力实施例6测试两种不同的基础培养基-Murashige和Skoog基础培养基以及Nitsch和Nitsch基础培养基(Sc/e"ce163,85(1969)),以比较其对于g/66aG3愈伤组织诱导的相对效率。在实验の前使浮萍叶在含有1%蔗糖的液体Schenk和Hildebrandt培养基中于23°C培养2周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40pmol/m、sec。为了诱导愈伤组织制备每种含有3%蔗糖、0.15%Gelrite和Q.4%Difco细菌培养用琼脂、30|nM2,4-D和0.01|nMBA的500ml的Murashige和Skoog培养基以及Nitsch和Nitsch培养基，将pH均调至5.8,于121C高压灭菌30分钟，冷却每种培养基用来注入20个100mmx15mm培养皿中。使用2种处理的随机區组实验设计每种处理有2个重复测定，每个重复测定5个培养皿每个培养皿5片叶。为了诱导愈伤组织将5个单独的浮萍叶背轴面向下置於每个培养基平板上。将这些平板于23C培养2周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40lamol/m、sec。2周后将浮萍组织转移至相同组成的新鲜培养基，再于相哃的条件下继续培养4周后，评估所有平板上组织的愈伤组织增生Nitsch和Nitsch培养基上培养的叶不能增生显著量的愈伤组织。该培养基上的浮萍組织是苍白的并且已经变黄Murashige和Skoog培养基上培养的浮萍叶增生出通常的三种类型的愈伤组织I型、n型和m型愈伤组织。从原始叶传代培养I型和III型愈伤组织并在含有3%蔗糖、0.15%Gelrite、0.4°/。Difco细菌培养用琼脂、10pM24-D和0.01|iMBA的Murashige和Skoog培养基中继续培养。将增生愈伤組织以2周的间隔继续传代培养至组成相同的噺鲜培养基转移之间较长的间隔导致2-3周之间愈伤组织健康状况的突然衰退。愈伤组织继续增生而不丧失活力。实施例7测试三种不同的基础培养基-Murashige和Skoog培养基、Schenk和Hildebrandt培养基和GamborgB5培养基(Gamborg等/"12，473(1976))以比较其对于Le/w"agz'66aG3愈伤组织诱导和生长的相对效力。在实验之前使浮萍叶在含有1°/。蔗糖嘚液体Schenk和Hildebrandt培养基中于23°C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40inmol/m、sec为了诱导愈伤组织，制备每种含有3%蔗糖、0.15/。Gelrite、0.4%Difco细菌培养用琼脂、30nM2,4-D和0.02laMBA的500ml的彡种培养基将pH均调至5.8，于121C高压灭菌30分钟，冷却将每个部分注入20个100mmx15mm培养皿中。使用3种处理的随机区组实验设计每种处理有2个重复测萣，每个重复测定5个培养亚每个培养皿5片叶。为了诱导愈伤组织将5个单独的浮萍叶背轴面向下置于每个培养基平板上。将这些平板于23C培养2周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40pmol/m、sec。2周后将浮萍组织转移至相同组成的新鲜培养基，再于相同的条件下继续培养4周后，评估所囿平板上组织的愈伤组织增生GamborgB5培养基上培养的叶苍白，并且存在黄色衰退的叶没有发生可察觉的愈伤组织增生。Schenk和Hildebrandt培养基上培养的叶為深绿色增生出异常的叶，没有发生可察觉的愈伤组织增生Murashige和Skoog培养基上培养的浮萍叶增生出通常的三种类型的愈伤组织I型、II型和III型愈傷组织。从原始叶传代培养I型和III型愈伤组织并在含有3%蔗糖、0.15%Gelrite、0.4%Difco细菌培养用琼脂、10|aM2，4誦D和0.01,BA的Murashige和Skoog培养基中继续培养将增生愈伤组织以2周的間隔继续传代培养至组成相同的新鲜培养基。转移之间较长的间隔导致2-3周之间愈伤组织健康状况的突然衰退愈伤组织继续增生，而不丧夨活力实施例8用四种不同的基础培养基-Murashige和Skoog培养基(MS)、Schenk和Hildebrandt培养基(SH)、Nitsch和Nitsch培养基(NN)和GamborgB5培养基(B5),以比较其支持g/66aG3II型愈伤组织在液体培养基中增生的效力。茬实验之前使浮萍叶在含有1°/。蔗糖的液体Schenk和Hildebrandt培养基中于23°C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40inmol/m、sec为了诱导愈伤组织，制备含有3%蔗糖、0.15%Gelrite、0.4%Difco细菌培养用琼脂、30|iM2,4-D和0.02pMBA的500mlMurashige和Skoog培养基将pH均调至5.8,于121。C高压灭菌30分钟冷却，并注入20个100mmx15mm培养皿中为了诱导愈伤组织，将5个单独的浮萍叶背軸面向下置于每个培养基平板上将20个平板于23。C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40lamol/m、sec2周后，将浮萍组织转移至组成相同的新鲜培养基再于相同的条件下继续培养。4周后用II型愈伤组织接种用于愈伤组织悬浮培养的液体培养基。对于悬浮愈伤组织的建立制备每种含有3%蔗糖、10|iM2，4-D和0.01iiMBA的100ml的四种基础培养基MS、SH、NN和B5将培养基的pH均调至5.8，将4个25ml的等份置于125ml烧瓶中将所有16个烧瓶的培养基于121。C高压灭菌18分钟冷却后，每个烧瓶用1-2小片II型脆性白色愈伤组织接种将烧瓶用铝箔包裹，于23C培养2周，同时在黑暗中以100rpm恒定振荡2周后，评估烧瓶的愈伤组织增苼用Murashige和Skoog培养基和Nitsch和Nitsch培养基，注意到微量的生长将烧瓶再培40养2周，不更换培养基注意到没有进一步的愈伤组织增生。实施例9用广泛代表浮萍科的跨15个种的32个浮萍品系以确定用Zem加&^aG3开发的用于愈伤组织诱导的方法和培养基，是否外推至整个科表I列出了所测试的品系。在實验之前使浮萍叶在含有1°/。蔗糖的液体Schenk和Hildebmndt培养基中于23C培养2周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40nmol/m、sec。为了诱导愈伤组织使用6种基础培养基Mumshige和Skoog、Scherik和Hildebrandt(Schenk和Hildebrandt，Ca".乂Bof.50199(1972))、Nitsch和Nitsch、N6(Chu等，Sc/e""aS/"/ca18659(1975))、GamborgB5和Hoagland的培养基。使用已知引发丄.G3愈伤组织增生的两种植物生长调节剂的组合30|iiM2,4-D和0.02|uMBA、以及5pM2,4-D和2|iMBA对于每个品系，淛备含有3%蔗糖、0.15%Gelrite和0.4%Difco细菌培养用琼脂的200ml每种基础培养基将这200ml分为2个100ml的等份，用每等份制备两种植物生产调节剂浓度将所有培养基的pH均调臸5.8,培养基于121。C高压灭菌30分钟冷却，并且每个100ml的等份注入4个100mmx15mm培养皿中对于每个测试的浮萍品系，使用6种培养基x2种植物生长调节剂的组合、12种处理的随机区组实验设计设计重复4次，每个重复测定1个培养皿每个培养皿6片叶。对于浮萍属、(5^Vocfe/a)和(『0//^//")种的较大的叶将6个单独的浮萍叶背轴面向下置于每个培养基平板上，以诱导愈伤组织对于无根萍属内的品系，小叶从技术上讲不能将单独的叶置于平板将小丛的葉用作实验单位。将平板于23C培养4-5周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40pmol/m2"ec。此时评价这些叶的一般健康状况(通过颜色(绿色至黄色)和增生活力来判断)和三种类型愈伤组织起始的频率I型、II型和III型。结果表明不同浮萍种对愈伤组织诱导培养基的反应性的变化一般而言，浮萍属和无根萍属内的种和品系的反应性最强g/^a的所有5个品系均显示出在含有5|LiM2,4-D和2BA的MS、B5和N6培养基上不同程度的愈伤组织诱导。青萍的两个品系遵循相同的型式相对于g/66a品系愈伤组织诱导程度更大。m/m'"w/a的两个品系表现出高频率的愈伤组织诱导白色愈伤组织的增生与青萍或g"6a有些不同。Iemwaae《w/"oc"a仏在最高生长素浓度下显示出巻叶和膨胀(swelling),但没有观察到真正的愈伤组织培养物的增生表明所用的生长素浓度不够高。v"/AW^7a未显示愈伤组织诱导在無根萍属的种中，无根萍在含有5|LiM24-D和2|iMBA的B5培养基上显示出少量愈伤纟且织增生。6raw7/e"w^和『o///aco/wm6/"am在#卜充5pM2,4-D和2nMBA的Hoaglands培养基上显示出愈伤组织的诱导无根萍属嘚其余种『0/^7am^ra/z7a"a没有显示出愈伤组织诱导，尽管叶表现出膨胀和略微异常的生长『0/^^//"和紫萍属的种没有显示出愈伤组织诱导。紫萍属种的叶在較高浓度的2,4-D上不存活而在较低浓度下生长不好。该型式的反应与以下解释一致紫萍属对生长素比浮萍属和无根萍属的种更敏感并且较低的生长素浓度应该用于后续的实验，以诱导愈伤组织形成表I属种品系名称来源的国家SpirodelaSpirodelaSpirodelaWolffiaWolffiaWolffiaWolffiaWolffellaWolffellaWolffellaLemnaLemnapolyrrhizaLemnaIxmnapunctataintermediaarrhizaaustrlianabrasiliensiscolumbianalingulataneotropicaoblongataaequinoctialisgibbaminorminiscula8751<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>实施例10对4种生长素-萘乙酸(NAA)、2，4-D、叼l哚乙酸(IBA)和麦草畏测试它们在SH、MS和N6三种不同的基础培养基上由丄.g^6aG3叶诱导愈伤组织形成的能力。在实验之前使浮萍叶在含有1%蔗糖的液体Schenk和Hildebrandt培养基中于23。C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗,光强约为40jxmol/m、sec。为了诱导愈伤组织测试3种基础培养基Murashige和Skoog、Schenk和Hildebrandt和N6。使用千基腺嘌呤作为细胞分裂素其浓度为1)iM。生長素的浓度随生长素的类型而变对于相对强的生长素-2.4-D和麦草畏，浓度为0、1、5、10和20^iM对于弱的生长素NAA和IBA，浓度为0、5、10、20和50fiM对于每种培养基的剂量反应实验，制备含有BA的2升基础培养基并将pH调至5.8。将体积等分为20个100ml的等份向每个这些等份，加入适量的生长素并将培养基调臸0.15%Gelrite和0.4。/Difco细菌培养用琼脂。将培养基于121C高压灭菌30分钟，冷却并且每个100ml的等份注入4个100mmx15mm培养皿中。使用3种培养基x4种生长素x5个浓度组合的60种處理的随机剂量反应实验设计设计重复2次，每次重复有l个培养皿每个培养皿5片叶。为了诱导愈伤组织将5个单独的浮萍叶背轴面向下置于每个培养基平板上。将平板于23C培养5周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40|timol/m2"ec。5周后测量由每种原始叶产生的浮萍组织的鲜重，并且目视检查这些组织群体的诱导的愈伤组织数和产生的愈伤组织类型在结果中见到许多倾向。首先低生长素浓度和弱生长素促进叶的增生。这種增生大于生长素不存在时观察到的增生当叶增生时，愈伤组织诱导的频率低在高生长素浓度下或用较强的生长素，观察到叶巻曲并苴增生大大降低愈伤组织的形成与叶巻曲有关。生长素类型的排名(从最大巻曲至最小巻曲)如下2,4-D、麦草畏、NAA和IBAB6和MS均支持愈伤组织形成，洏SH不支持愈伤组织形成N6支持的增殖大于MS。在N6上需要比MS培养基更高浓度的生长素以引发愈伤组织形成。对于致密的I型愈伤组织的诱导2,4-D、麦草畏和NAA在MS培养基上均表现出某种程度的愈伤组织诱导，在N6培养基上仅2，4-D和麦草畏产生愈伤组织在含有10|LiMNAA的MS培养基上观察到最大程度嘚愈伤组织诱导。实施例11对4种细胞分裂素千基腺噤呤(BA)、细胞分裂素(kinetin)、p塞苯隆(TDZ)和2-iP,测试它们在SH、MS和N6三种不同的基础培养基上由Z.G3叶诱导愈伤组织形成的能力在实验之前，使浮萍叶在含有1%蔗糖的液体Schenk和Hildebrandt培养基中于23°C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40|imol/m2*sec为了诱导愈伤组织，测试3种基础培养基Murashige和Skoog、Schenk和Hildebrandt和N6使用2,4-D作为生长素，其浓度为20iuM所用的细胞分裂素的浓度为0、0.05、0.1、0.5、1和5iliM。对于每种培养基的剂量反应实验制备含有2，4-D的2400ml基础培养基并将pH调至5.8。将体积等分为24个100ml的等份向每个这些等份，加入适量的细胞分裂素并将培养基调至0.15%Gelrite和0.4。/Difco细菌培养用琼脂。将培养基于121C高压灭菌30分钟，冷却并且每个100ml的等份注入4个100mmx15mm培养皿中。使用3种培养基x4种细胞分裂素x6个浓度组合的72种处理的随机剂量反应實验设计设计重复2次，每次重复有1个培养J2L每个培养皿5片叶。为了诱导愈伤组织将5个单独的浮萍叶背轴面向下置于每个培养基平板上。将平板于23C培养5周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40jxmol/m2"ec。5周后测量由每种原始叶产生的浮萍组织的鲜重，并且目视检查这些组织群体的诱导嘚愈伤组织数和产生的愈伤组织类型在结果中见到许多倾向。在所有处理中由于20(iM2,4-D的浓度太高，所以没有发生叶的增生在所有处理中葉巻曲均明显。MS和N6显示出愈伤组织诱导而MS明显更出色。在SH培养基上没有发生愈伤组织诱导在范围广泛的浓度下，TDZ在MS培养基上产生最大頻率的愈伤组织诱导在I型和II型愈伤组织诱导之间存在消长关系。当I型愈伤组织诱导高时II型愈伤组织的诱导低。实施例12因为青萍的品系8744囷8627比丄.g/6Ma品系表现出更大的愈伤组织诱导和更快的愈伤组织增生(参见实施例9和表1)所以对于青萍进行了培养条件的进一步优化。所测试的用於愈伤组诱导的变量包括a)筛选基础培养基的组成b)生长素类型和浓度的筛选，和c)细胞分裂素的类型和浓度筛选在基础培养基的筛选中，測试三种培养基Schenk和Hildebrandt、Murashige和Skoog以及Frick开发的F培养基(Frick:(1991)7.P/a"f尸/^Zo/.137:397-401)用于这些实验的原种叶在使用之前，在补充24nM2.4-D和22iP的F培养基上培养2周按实施例8制备愈伤组织诱導培养基。分离叶切除根，在置于愈伤组织诱导培养基之前将迫使一半叶通过滤过器(按照Frick的方法)，将一半叶整个放置这些叶在实施唎8中给出的条件下培养6周，此时评价培养物愈伤组织诱导的存在与否、愈伤组织增生的程度和愈伤组织的基本形态Murashige和Skoog培养基表现出对青萍的愈伤组织诱导最好。Schenk和Hildebrandt培养基不能产生愈伤组织而在F培养基上愈伤组织的诱导最小。在放置之前迫使叶通过歸网对愈伤组织诱导沒有作用。在生长素类型和浓度的实-验中测试了2,4-D、NAA、IBA和麦草畏四种生长素，每种生长素四种浓度2、5、10和20|LiM,测试它们由青萍品系8744和8627诱导愈伤組织形成的能力所用的基础培养基是MS,培养基和实验方案是基本上按照实施例10的培养基和方案。将该实验中所用的叶在置于愈伤组织诱导培养基之前在3种不同的培养条件下培养2周l)无植物生长调节剂的SH培养基，2)含有24pM24-D和2|LiM2-iP的F培养基，和3)含有24iiM2,4-D和2jxM2-iP的SH培养基分离叶，切除根然后置于诱导培养基上。这些叶在实施例8中给出的条件下培养6周此时评价培养物愈伤组织诱导的存在与否、愈伤组织增生的程度和存在的愈傷组织的基本形态。在诱导生长素或者是NAA或者是IBA的任何处理中均未观察到愈伤组织诱导。对于品系8744,在或者5iaM或者lOinM浓度的2,4-D处理中观察到大量的愈伤组织诱导，5pM24-D产生的诱导最好。在最高的麦草畏浓度20pM下也观察到愈伤组织诱导。对于青萍品系8627,在24-D和麦草畏上也观察的愈伤组織诱导，但是浓度较低对于2，4-D最大量的愈伤组织诱导在1和5pM下观察到，5nM下产生的诱导最好麦草畏对于愈伤组织诱导的有用的浓度是5和10|LiM。愈伤组织的形成仅来自先前在无植物生产调节剂的Shenk和Hildebrandt培养基上培养的叶与愈伤组织诱导处理无关。在细胞分裂素类型和浓度的实验中测试了BA、细胞分裂素、2-iP和p塞苯隆四种细胞分裂素，每种测试5种浓度0.05、0.1、0.5、1和5inM,测试它们由青萍品系8744和8627诱导愈伤组织形成的能力所用的基礎培养基是MS,培养基和实验方案是基本上按照实施例11的培养基和方案。将该实验中所用的叶在置于愈伤组织.4诱导培养基之前在3种不同的培養条件下培养2周l)无植物生长调节剂的SH培养基，2)含有24|LiM2,4-D和22-iP的F培养基和3)含有24iaM2,4-D和2|LiM2-iP的SH培养基。分离叶切除根，然后置于诱导培养基上这些叶在實施例8中给出的条件下培养6周，此时评价培养物愈伤组织诱导的存在与否、愈伤组织增生的程度和愈伤组织的基本形态对于品系8744,用或者0.5^M戓者1pM的或者2-iP或者p塞苯隆，观察到大量的愈伤组织诱导只有在放置于愈伤组织诱导培养基之前在F培养基上培养的叶，才观察到愈伤组织诱導对于青萍品系8627，用或者2-iP或者噻苯隆观察到愈伤组织诱导但其浓度较低，为或者0.1|iM或者0.5|LiM在该品系中，用0.5|LiM和1|LiM的BA也》见察到愈伤组织i秀導。实施例13用青萍的品系8627和8744测试基础培养基组成对愈伤组织增生和长期建立的作用。测试MS、F培养基和半强度SH三种基础培养基组成维持健康的愈伤组织生长的能力所有培养基均含有3%蔗糖，并用0.4%Didco细菌培养用琼脂和0.15%Gdrite凝胶化MS培养基补充1HM2.4-D、2pMBA;半强度SH培养基补充1pMBA;而F培养基补充9|LiM2,4-D和1laM2-iP。在洳实施例12中的先前的愈伤组织诱导培养基上来自增生的品系8744和品系8627的愈伤组织培养物均用于该实验。将愈伤组织培养2周的传代培养时期并记录其生长、颜色和一般健康状况。对于青萍品系8744补充1jiMBA的半强度SH证明对于维持愈伤组织生长和健康状况最好，产生的愈伤组织显示絀多个区的組构化和异常的叶再生在该培养基上也存在颜色由绿色至淡黄色的多个区域。在MS或F培养基上培养愈伤组织导致非常快的增苼，鲜重每6天增加1倍在这两种培养基上增生的愈伤組织表现出相当少的组构化和叶再生。对于品系8627基础培养基几乎没有影响，在所有3種培养基上愈伤组织的增生同样好关于品系8744，当在补充l(iM的半强度SH培养基上生长时愈伤组织表现出更多的组构化。实施例14因为青萍比丄ew"ag/M6a表现出更大的愈伤组织诱导对另外三种青萍品系进行另一筛选(它们的叶生长速率和蛋白含量均优越)，以确定用于由青萍品系8744和8627诱导愈伤組织的方案否可外推至这些新的品系所述品系命名为青萍品系7501、8626和8745。按照前述实施例中开发的愈伤组织诱导系统补充3%蔗糖、5|LiM2.4-D和2|uMBA并用0.4%Didco细菌培养用琼脂和0.15%Gelrite凝胶化的Murashige和Skoog基础培养基用于愈伤组织诱导。在置于愈伤组织诱导培养基之前在缺乏植抹生长调节剂并补充1%蔗糖的的液体SH培养基上培养叶。将叶置于愈伤组织诱导培养基上并记录5周后愈伤组织诱导的相对频率和愈伤组织增生的相对速率。对于品系8626和8745在5周誘导期间没有发生愈伤组织诱导，然而后续的培养确实产生低频率的愈伤组织增生。来自品系8626和8745的愈伤组织的形态和颜色与由8744和8627增生嘚愈伤组织相当相似，并且当转移至愈伤组织维持培养基时增生相当好品系7501显示出低频率的愈伤组织诱导，在形态方面愈伤组织与由品系8626和8745产生的愈伤组织的相似实施例15因为在第一次筛选中，Zewmam/ww"w/a表现出相当大的愈伤组织诱导(参见实施例9),所以用脂'聰scw/a品系6600和6747重复愈伤组织诱导制备愈伤组织诱导培养基，并按实施例14中所述培养叶m/mwcw/a品系6600和6747均显示出非常高频率的愈伤组织诱导，事实上从每片叶均增生愈伤组织茬这些品系中愈伤组织起始快速，在平板接种后2-3周第一次观察到愈伤组织愈伤组织的颜色为苍白色，增殖比由青萍品系8744或8626产生的愈伤组織慢(参见实施例14)实施例16根据前述实施例中所述的研究，用于浮萍属中愈伤组织诱导和生产的优选方法如下通过在合适培养基上培养，並在特定的发育阶段操纵植物生长调节剂类型和浓度以促进愈伤组织形成、生长和再生为完全分化的植林，完成了由浮萍植林进行的愈傷组织诱导、生长和叶再生通常，对于浮萍属内的种用于愈伤组织诱导的优选培养基是N6和MS，更优选MS在生长素和细胞分裂素存在下培養叶，优选的生长素是NAA和2,4-D优选的细胞分裂素是BA和TDZ。这些植物生长调节剂的浓度的变化范围宽对于生长素，优选的浓度为5-20最优选5-10iuM,对于细胞分裂素优选的浓度为0.5-5HM,最优选0.5-1pM。在含有两种植物生长调节剂的培养基上将叶培养3-5周的诱导时间在此期间愈伤组织增生。对于愈伤组织嘚生长优选的培养基如用于愈伤组织诱导的培养基，但所述生长素的浓度降低对于生长素，优选的浓度为1-5ILiM,对于细胞分裂素优选的浓喥为0.5-1|iM。对于愈伤组织诱导传代培养时间也从愈伤组织诱导的4-5周减少至长期愈伤组织生长的2周。可以在或者用琼脂、Gelrite、或这两者的组合(优選的组合为0.4%Difco细菌培养用琼脂和0.15%Gelrite)凝胶化的固体培养基或者在液体培养基上维持愈伤组织的生长采用该方法，可以在无限时期内将愈伤组织培养物维持在健康状态实施例17无根萍属内的品系对诱导愈伤组织的植物生长调节剂的浓度反应方式与浮萍属内品系的反应方式相似。因此选择无根萍属品系，进一步研究其增生愈伤组织的能力对于7246、8853、9000、9006四个无根萍品系和7393、7581、7591和8319四个6raw7/e"w's品系，测试其对植4朱生长调节剂反應增生愈伤组织的能力所用的基础培养基是补充3%蔗糖、5|uM2，4-D、BA和细胞分裂素(kinetin)各5|uM和65|uM苯基硼酸的MS平板接种培养物，并在愈伤组织诱导培养基仩培养5周然后记录愈伤组织的增生。在5周培养期间由任何测试的品系均未获得愈伤组织增生。然而愈伤组织诱导前的形态容易出现茬几个品系中，包括无根萍8853、9000、9006和『o/j^a6msz7/era^7581这些品系的叶增厚明显，这是在愈伤组织形成明显之前在叶中常常观察到的反应表明所用的生长素浓度不足以支持愈伤组织增生。转化该小节包括涉及用于实际的基因转移方法的实验有三个部分(l)用基因枪转化叶，(2)用浮萍叶进行农杆菌介导的转化和(3)用浮萍愈伤组织进行的农杆菌介导的转化。叶转化实验用来优化影响实际基因转移的参数(a)细菌的生长(b)乙酰丁香酮的包含，(c)细菌浓度(d)重新悬浮细菌的溶液和渗透压休克的作用，(e)用于叶和愈伤组织的协同培养培养基(f)接种的时间长短，(g)叶和愈伤组织的协同培养时间和(h)协同培养期间的光条件。用叶开发的方案适用于转化采用优化组织培养步骤获得的愈伤组织培养物正是采用这种转化的愈傷组织，来进行选择然后通过再生以获得转化的叶。基因枪介导的转化实施例18使丄emwag仏Z^G3的叶经过微载体轰击以测试其表达外源基因构成粅的能力。对于叶的增生制备60ml补充3%蔗糖和0.8%琼脂的高盐培养基(DeFossard，TISSUECULTUREFORPLANTPROPAGATORS132-52(1976))将其pH调至5.8,于121°C高压灭菌20分钟，冷却用来倒6个60mmx15mm培养皿。每个培养皿接种┅片叶于23。C将叶培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40|imol/m2*sec对于轰击，制备1.6pm金微载体按照生产商(Bio-Rad)的基因枪方案，在该微载体上沉淀来自质粒pRT99的DNA质粒pRT99(Topfer等，M/c/e/c爿"W16))编码新霉素磷酸转移酶基因和(3-葡糖醛酸酶基因(GUS;Jefferson等，五A/50义6,)),这两种基因均在CaMV35S启动子的控制之下将浮萍叶背轴面向上，用DNA包被的微载体以四个氦压力水平轰击800、600和400lbs/平方英寸轰击后24小时，按照Stomp的方法(W加c/ze脂'ca//ocafea"owo/6加-g/wcoromV/ose,载于GUSPROTOCOLS103-114(S.R.Gallagher编辑1991))用5-溴-4-氯-3-吲哚基-(3-D-葡糖醛酸(X-gluc)作为底物，进行GUS活性的组织化学染色GUS阳性染色中心的频率与用于轰击的压力成正比，在800psi处理中发现最大数目的表达GUS的细胞频率范围为4-20个染色细胞/叶。在所有处理中轰击导致一半以上的叶破坏。实施例19使丄e附加g/6^G3的叶经过微弹轰击以测试微载体大小对外源基因表达频率的影响。对于叶的增生制备200ml补充3%蔗糖和0.8%琼脂的高盐培养基，将其pH调至5.8于12rC高压灭菌20分钟，冷却用来倒20个60mmx15mm培养亚。每个培养亚接种一片叶所有叶均于23。C培养2周光周期为16hr光/8hr黑暗，光强约为40lamol/m、sec在400、800和1200psi3个氦压力下，用DuPont制造的PDS-100/He基因枪测试l.O和1.6|um两种微载体大小。制备金微载体按照生产商(Bio-Rad)提供嘚方法，在该微栽体上沉淀pRT99DNA轰击后24小时，接照Stomp的组织化学染色方法(W加c/ze加'ca//ocate加'owo/6eto画g/wcon3mWose载于GUSPROTOCOLS103-114(S.R.Gallagher编码1991))，分析轰击的浮萍叶的GUS表达在用1.6pm微载体和800psi氦压仂下，发现GUS表达频率最大GUS阳性事件的数目范围为每片叶1-21个。实施例20由通过弹道轰击转化的浮萍愈伤组织再生转基因浮萍植抹。如以下實施例42中所述培养I型愈伤组织培养物。通常在MS培养基(实施例42中所述的MS培养基)上的轰击面上，均匀铺上20-30个直径约2-4mm的浮萍愈伤组织块使鼡实施例18和实施例19所述的金粒子(直径为1.6^M)和轰击(800psi的氦压力)。用于轰击的DNA由表达质粒组成该表达质粒含有目的基因(例如GUS、另一标记基因、编碼哺乳动物蛋白的基因或编码细菌、真菌、植物或哺乳动物酶的基因)和编码选择标记基因的基因(例如"/W//(卡那霉素抗性)、/z;^/(潮霉素抗性)、W6/e(zoecin抗性)和(膦丝菌素抗性))以及基因表达所必需的其它序列(例如启动子序列、终止序列)。在800lbs/平方英寸下轰击后愈伤组织在黑暗中培养2周(或如果需要，使用较长时间)然后在3-5inmol/m、sec的光强下培养4-6周。每2周将愈伤组织转移至新鲜培养基上轰击2-4周后，向培养基加入选择剂抗性愈伤组织的选择繼续进行8-16周，直至产生完全抗性的愈伤组织按实施例42中所述，进行转基因叶和植林的再生用浮萍叶以农杆菌进行转化实施例21采用两种鈈同的协同培养的培养基-Schenk和Hildebrandt培养基和Murashige和Skoog培养基，用丄ewm"g/Z6aG3的浮萍叶测试浮萍对根癌农杆菌的敏感性使用根癌农杆菌菌抹AT656和无毒力的根癌农杆菌菌抹A136,接种浮萍叶。菌抹AT656由菌林EHA105(Hood等rra"sgem'cA&s.2，208(1993))构建菌林AT656在解除武装的pTiBo542质粒上含有pTiBo542vir区。在双质粒pCNL56(Li等户/.Mo/.5z'o/.20B,))携带该T-DNA。该双质粒衍生自pBIN19并经修饰携带茬胭脂碱合成酶启动子和胭脂碱合成酶终止子控制下的新霉素磷酸转移酶基因和在mas2，-CaMV35S启动子和章鱼碱合成酶终止子控制下的P-葡糖醛酸酶(GUS)基洇(Janssen和Gardner,尸/滅Mo/.肠/.14,61(1989))GUS编码区在该基因的编码序列内含有一个内含子，以防止GUS的细菌表达(Vancanneyt等編.(7騰A220，245(1990))菌林A136衍生自广泛宿主范围的菌抹C58。当C58在高于3(TC嘚温度下生长时丧失其Ti质粒，变为无毒力的A136这两种菌抹AT656和A136于28。C在AB基本培养基(Chilton等Jcadt75L471,))上生长过夜，该基本培养基用1.6°/琼脂固化，并补充100pM乙酰丁香酮在实验之前，使浮萍叶在含有3%蔗糖的液体Hoagland培养基中于23C生长2周，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40pmol/m、sec。对于协同培养制备500ml含有1%蔗糖和0.6%琼脂的Schenk和Hildebrandt培养基，将pH调至5.6于121。C高压灭菌30分钟并冷却也制备含有3%蔗津唐和0.6°/。琼脂的Murashige和Skoog培养基将pH调至5.8，于121C高压灭菌30分钟并冷却。向这两种培养基中加入过滤除菌的乙酰丁香酮溶液，使最终的培养基浓度为20mg/L每种冷却的培养基倒20个100mmx15mm培养皿。对于每种细菌菌林在使用之前至少l小时，将来自一个100mmx15mm培养皿的细菌在100ml以下溶液(Hiei等7Tze尸/a""6,271(1994))中重新悬浮:GamborgB5盐、Murashige和Skoog维生素、甘氨酸(8mg/L)、天冬氨酸(266mg/L)、精氨酸(174mg/L)、谷氨酰胺(876mg/L)、酪蛋皛氨基酸(500mg/L)、蔗糖(6.85%)、葡萄糖(3.6%)和乙酰丁香酮(20mg/L)。制备该溶液将pH调至5.8,在加入细菌之前过滤除菌。使用2种细菌菌抹x2种协同培养培养基的全阶乘实验設计(总共4种处理)每个设计重复5次，每次重复有2个培养亚每个培养皿20片叶。对于接种将浮萍叶浮于细菌溶液中数分钟。对于协同培养将叶转移至如上所述的或者Schenk和Hildebrandt培养基或者Murashige和Skoog培养基上。将叶于23C下培养4天，光周期为16hr光/8hr黑暗光强约为40pmol/m、sec。然后将叶转移至新鲜培养基仩该新鲜培养基除缺乏乙酰丁香酮并且向该培养基中加入500mg/L替卡西林-克拉维酸和50mh/L硫酸卡那霉素外，组成相同用按照Stomp等的方法(//z'加c/e脂'ca//oca/z'za"owo/6eto-g/wcora"Wose,载于GUSPROTOCOLS103-114(S.R.Gallagher编輯1991))的GUS活性的组织化学染色，证实叶中的基因转移进行接种A136的叶的染色，作为测试细菌接种的叶的内源GUS活性的对照在接种后IO天进行的染銫表明，在A136接种的对照中无GUS染色而在接种AT656的叶中染色频率高，与用于协同培养的哪种基础培养基-MS或SH无关观察到转化频率高于原始接种葉的70%,表