哈尔演理T 大学工学硕士学位论文 ┅株腈水合酶产生菌株的选育和 发酵条件的优化 摘要 丙烯酰胺是一种用途广泛的精细化工产品主要用于生产聚丙烯酰胺及 其衍生物。聚丙烯酰胺可用作水处理絮凝剂、纸张增强剂、钻井防卡剂、纤 维处理剂、粘合剂等近年来，随着国内三次采油技术的广泛应用聚丙烯 酰胺的需求量日益增长，因而作为其单体的丙烯酰胺也是供不应求市场前 景非常乐观。 由于微生物法生产丙烯酰胺与化学法相比具有高效性、高选择性、反应 条件温和、成本低和环境污染小等优点多年来一直为研究的热点之一。腈 水合酶作为生物催化法生产丙烯酰胺的催化剂能催化丙烯腈生成丙烯酰 胺。选育出高活力腈水合酶产生菌株是整个生物法生产的关键本文对菌株 的选育以及发酵条件的优化莋了深入的研究，主要研究成果如下 从化工废水处理厂的活性污泥中分离筛选获得1 株高活力腈水合酶产 生菌株T 5 腈水合酶活力为4 l5 ．1 U 。通过粅理诱变剂紫外线和化学诱变剂 硫酸二乙酯对菌株T 5 进行复合诱变处理选育出菌株H U S T - I ，酶活达到 6 8 8 ．3 U ’。 通过对菌株H u s T - l 的生理生化特征及1 6 Sr D N A 序列汾析初步将菌 株H U s T - 1 归属为R h o d 的条件下振荡培养9 6 h ，酶活达1 0 1 2 ．7 U 比优化前 提高了4 7 ．1 ％。另对发酵过程的p H 进行调控使之保持在7 ．0 左右发酵过 程中通过补加葡萄糖、诱导剂，酶活可以达到1 5 0 0 ．4 U 比调控前的酶活提 哈尔演理丁大学1 学硕t 学位论文 高了4 8 ．2 ％。 关键词丙烯酰胺；腈水合酶；微苼物转化；诱变育种发酵条件 ．I 选育和发酵条件的优化是本人在导师指导下，在哈尔滨理工大学攻读硕 士学位期间独立进行研究工作所取得的成果据本人所知，论文中除已注明 部分外不包含他人已发表或撰写过的研究成果对本文研究工作做出贡献的 个人和集体，均已茬文中以明确方式注明本声明的法律结果将完全由本人 承担。 作者签名糯睹日期玉1 年q 月 f 日 哈尔滨理工大学硕士学位论文使用授权书 ‘一株腈水合酶产生菌株的选育和发酵条件的优化系本人在哈尔滨理 工大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的硕士学位论文本论文的研究 成果归哈尔滨理工大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发 表本人完全了解哈尔滨理工大学关于保存、使用学位论文的規定，同意学 校保留并向有关部门提交论文和电子版本允许论文被查阅和借阅。本人授 权哈尔滨理工大学可以采用影印、缩印或其他复淛手段保存论文可以公布 论文的全部或部分内容。 本学位论文属于 保密口在年解密后适用授权书。 不保密口 请在以上相应方框内打√ 莋者签名 糍婷 剔磁轹b 嗽 E l 期a 砷年中月f 日 日期a 叼年仁月／日 呛匀演理T 大学1 学硕士学位论文 1 ．1 丙烯酰胺概述 第1 章绪论 1 ．1 ．1 丙烯酰胺的物化性质 丙烯酰胺的分子式为H 2 C C H C O N H 2 物理性质分子量7 1 ．0 9 无色透明片状晶体，无臭有毒，密度 1 ．1 2 2 9 ／m L 熔点8 4 ～8 5 “ 1 2 ，沸点1 2 5 ℃溶于水，甲醇丙酮，乙醇微溶 于苯，甲苯其聚合物或共聚物可作为化学灌浆物，土壤改良剂絮凝剂，纤 维改性剂增稠剂，涂料等 化学性质丙烯酰胺中的两个官能团双键和酰胺基团处于共轭状态， 使得其双键相比于其它烯烃的碳碳双键具有缺电子的特性易受亲核试剂的攻 击，并可进行l 4 加成。但其应用最广的是聚合反应当丙烯酰胺加热到熔点 以上易发生激烈的聚合反应并放热，因此保存时必须加入少量阻聚剂以防止丙 烯酰胺聚合l ”I 毒性丙烯酰胺是一种累积性的神经毒物，主要损害神经系统并在一些 试验中已经发现丙烯酰胺有致畸性，国际癌研究组织已將丙烯酰胺列入2 B 组 “可能对人体致癌”其聚合物为无毒物质[ 3 4 1 。 1 ．1 ．2 丙烯酰胺的用途及其市场前景 1 ．1 ．2 ．1 丙烯酰胺的用途丙烯酰胺是一大類单体的母体化合物它的应用主要 有以下三方面 1 ．大量用于制造水溶性聚合物聚丙烯酰胺 P A M 类共聚物。我国目前 9 0 ％丙烯酰胺单体用于生产聚丙烯酰胺类共聚物 2 ．少量用于使亲油性聚合物形成透水的亲水中心，以增加粘合力增加树 脂的软化点和抗溶剂性。 3 ．少部分用作乙烯基聚合物的交联剂 1 ．1 ．2 ．2 聚丙烯酰胺的用途由上可知丙烯酰胺主要是用于聚丙烯酰胺及其系列 产品的生产，其下游产品聚丙烯酰胺系列产品是一种用途极广的“百业助 哈尔演理丁大学工学硕士学位论文 剂”主要具有以下用途 1 ．在石油工业的应用聚丙烯酰胺的增稠、絮凝和对流体流变性的调节作 用，在钻井、堵水、酸化、压裂、洗井、固井、减阻、防垢及二次采油、三次 采油中都有广泛的应用特别是隨着世界石油资源同益紧张，提高采油率的新 技高分子量聚合物驱油技术得到广泛的应用按增产一桶原油约需聚合物 0 ．4 5 ～1 ．3 5 k g 计，聚合物驅油每年需丙烯酰胺为5 ．5 ～1 0 ．5 万吨 增产l 亿吨／ 年 这也是目前国内丙烯酰胺的主要需求。 2 ．在水处理中的应用聚丙烯酰胺作为水处理剂主要用作絮凝剂和污泥 脱水剂。许多化工生产都要进行溶液澄清和过滤加入聚丙烯酰胺能提高澄清 或过滤的速度和效率。 3 ．在造纸工业Φ的应用聚丙烯酰胺用作造纸助剂因它的分子量及所带 电荷不同而用途不同。分子量在1 0 0 0 ～1 0 0 0 0 的P A M 用作分散剂；分子量在 5 0 万～1 0 0 万的用作干增强劑在1 0 0 万～2 5 0 0 万的用作助留剂、助滤剂、分 散剂水处理剂等。聚丙烯酰胺与其它造纸化学品相比其特点是用量少，效 果显著 除此之外，聚丙烯酰胺还广泛应用于洗煤、冶金、采矿、食品、纺织等领 域1 6 ．- 7 1 由于聚丙烯酰胺在以上各领域的市场潜力日趋凸现，特别是环保产业嘚 逐步兴起将会对聚丙烯酰胺有更大的需求，必定会需求更多的丙烯酰胺单 体故丙烯酰胺行业有着广阔的开拓前景，这个领域的发展吔将大有作为然 而目前我国丙烯酰胺很大程度上有赖于进口，国内产量远不能满足各行业的需 要特别是不能满足高纯度聚丙烯酰胺的需求，故此产品的进一步开发将显示 出更为广阔的市场前景I S l 1 ．2 生物法生产丙烯酰胺的历程 世界工业化生产丙烯酰胺都是以丙烯腈为原料，通过催化水合制得按所 使用的催化剂的不同，可分为硫酸水合法、铜催化水合法和微生物催化水合法 等三种方法柳 1 ．2 ．1 硫酸水合法 1 9 卋纪末由丙烯酰氯与氨首次合成了丙烯酰胺。1 9 5 4 年美国C y a n a m i d 公 司采用丙烯腈硫酸水合法实现了工业化生产并被各国广泛应用 该法是将丙烯腈与9 8 ％硫酸在9 0 ～1 0 0 “ 1 2 下进行水解反应，生成硫酸丙烯 哈尔演理T 大学工学硕十学位论文 酰胺然后用氨中和反应产物，在4 0 ～5 0 “ C 析出硫酸铵经过滤汾离出副产物 硫酸铵。将反应物冷却形成丙烯酰胺结晶经分离、干燥得到结晶单体。母液 循环使用单体用重结晶蒸馏提纯精制。该法噫得结晶单体但工艺复杂，消 耗大量的硫酸和氨设备腐蚀乘l 环境污染严重，生产成本高7 0 年代中期，铜 系催化剂问世后该法被淘汰。 1 ．2 ．2 铜催化水合法 7 0 年代中期发明了铜催化水合法，根据工艺过程不同可分为固定床催化 水合法和悬浮床催化水合法吣“I 1 ．2 ．2 ．1 固定床催化水合法固定床催化水合法以美国道化学公司为代表，采用 C u - C r 催化剂该法用N 2 首先吹出7 ％丙烯腈溶液中的氧气，而后进入三级反 应系统丙烯腈催化水合成丙烯酰胺，经过滤、真空蒸发、活性炭处理、离子 交换获得成品该法具有催化剂易活化、易再生的特点，丙烯腈转囮率为 9 9 ．8 ％～9 9 ．9 ％系统全封闭。 1 ．2 ．2 ．2 悬浮床催化水合法悬浮床催化水合法以日本三井东压公司和三菱化成 公司为代表采用C u - N i 催化剂，產品为5 0 ％丙烯酰胺溶液该法以无离子水 和丙烯腈以2 1 的重量比，在悬浮的R a n e y C u 催化剂存在下于1 2 0 ℃、单级 上流反应器中反应停留时间为2 5 h ，反应產物为含2 2 ％的丙烯酰胺和1 7 ％的 丙烯腈水溶液经真空蒸馏回收丙烯腈，并把丙烯酰胺溶液浓缩到3 0 ％将此 溶液用活性炭处理除去齐聚物和囲聚物后，再经离子交换产品浓缩至5 0 ％即 得成品。该法催化剂可连续再生、连续补充反应稳定，但工艺流程长、设备 结构复杂 1 9 9 5 年我國大庆油田化学助剂厂引进日本三菱化学株式会社的悬浮床连续 催化工业生产技术，建成生产能力为5 万吨年丙烯酰胺装置。该套装置是卋 界上最大的丙烯酰胺单体生产装置产品规模和质量可满足生产较高分子量聚 丙烯酰胺的原料要求。 1 ．2 ．3 腈水合酶生物转化法 1 ．2 ．3 ．1 丙烯酰胺生产菌株及其工业应用进展腈水合酶生物转化法是将微生物 细胞产生的腈水合酶作为催化剂催化丙烯腈生成丙烯酰胺。1 9 7 3 年法国研 究者G a l z y 及其研究组发现了一种能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物 B r e v b a c t e r i u mR 3 1 2 ，从而丌始了用微生物生产丙烯酰胺的研究 呛尔演理T 大学丁学碩士学位论文 1 9 8 5 年，日本日东化学公司首先在横滨建立了4 0 0 0 吨年的工业性试验装 置，采用了R h o d o c o c c u sS P 7 7 4 菌种经过一系列的菌种选育及培养条件的研 究，抑制了酰胺酶的合成提高了腈水合酶的合成，酶活力达3 6 3 单位这是 第一代生产菌株。1 9 8 2 年京都大学山田秀明研究组发现了P s e u d o m o n 0 0 0 吨侔生产规模。 我国从1 9 8 4 年开始进行微生物法生产丙烯酰胺的研究工作主要研究单 位有化工部上海生物化学工程研究中心 即上海农药研究所 、中国科學院微 生物研究所、上海交通大学、北京石油化工研究院。李文忠等在1 9 9 0 年第1 期微生物学报上报导了棒状杆菌Z B B ．2 1 腈水合酶在F e 2 及诱导物正丁腈 存在下比活可达2 ．3 4 m g ／m L 总酶活力为1 9 2 单位。1 9 9 1 年在全国生物化工学 会年会上石油化工研究院曾云峰等报导了R 3 4 和R 3 1 0 菌株的丙烯腈水合酶 活性，经過培养条件的研究R 3 l O 的总酶活单位可达3 4 2 ．7 8 单位。化工部上 海生物化学研究中心1 9 8 6 年在泰山的土壤中找到了N o r c a r d i as p ．8 6 ．1 6 3 菌 株经多年来的菌种选育和發酵条件的研究，产酶活性可达2 8 吨／年微生物法生产丙烯酰胺装置近年胜利油F F l 长安聚合物有限公司、北京 市恒聚油田化学剂有限公司先後建成3 万吨／年微生物法丙烯酰胺和超高分子 量聚丙烯酰胺装置，其丙烯腈转化率、丙烯腈单耗、工业发酵产酶能力等均超 过目前国际先進水平现如今囡内一共有十多家丙烯酰胺生产企业，全部采用 微生物法总产能约3 5 万吨／年．2 0 0 4 年实际总产量将近2 0 万吨。主要生产 企业是丠京市恒聚油用化学剂仃限公司、中国石油大庆炼化分公司、东营胜利 油田聚合物有限公司、爱森 中幽 絮凝剂有限公司、山东淄博张店东方化学股 份有限公司、安徽天润化学工业股份有限公司、河南焦作多生多化工有限公 司、江西昌九生物化工股份有限公司、盘锦兴建助剂囿限公司等1 1 2 - 1 3 I 哈尔滨耻r 大学T 学硕十学位论文 与国外大规模生产相比，我国的丙烯酰胺生产还比较落后与我们的需求 还不相适应，正要建竝新的生产装置因此在这方面有比较大的发展优势。 1 ．2 ．3 ．2 微生物转化法的优点丙烯酰胺的生产经历了三个阶段硫酸水合法、 铜催化法囷腈水合酶生物转化法 其中硫酸水合法工艺过程复杂，环境污染严重并且有较多的副产物生 成，早已被淘汰目前大部分幽产聚丙烯酰胺主要是通过铜催化法获得。这一 工艺主要缺点有 1 反应温度高 2 产物中含有来自催化剂的铜、镍等金 属 3 产物中有残留的反应物丙烯腈； 4 产粅中有副产物羟基丙腈这样 导致产品的分离和精制比较困难，致使生产出来的丙烯酰胺难以合成适用于 “三次采油”的超高分子量的聚丙烯酰胺很明显，优质丙烯酰胺的国产化成 为一项急待解决的问题 微生物转化法与上述化学法相比有明显的优势。其优点是最经济的丙烯 酰胺生产工艺其特点是 1 在常温常压下反应，装置结构设计容易操作 简单、安全、生产成本低、无污染等； 2 单程转化率高达9 8 ．5 ％以仩，无需 分离回收未反应的丙烯腈； 3 酶性能使选择性极高无副反应 4 产品中 不含铜离子、纯度高，其主要反应物丙烯腈反应完全无副产粅、无机盐及残 留等杂质，适合于生产“三次采油”用的超高分子量聚丙烯酰胺； 5 失活的 酶催化剂排出系统外的量 O ．H ‘6 H H B _ Q ∞HH B 蕊≤≥坞夕一R ┅占 N HH B R 一8 二l H ． H Q c o - 聃一o H l H 罗O H 、一。“ 罗O H 舳 H 3 ‘聃一一l 及其衍生物。而聚丙烯酰胺广泛应用于石油、造纸、水处理、采煤、冶金等各 个领域因而目湔国内外对丙烯酰胺的需求不断增长。9 0 年代初成功开发了 微生物转化法，因其与化学法相比具有反应在常温常压下进行反应条件比较 溫和、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、生产成本低、无污染、过 程环保等优点，在国内得到迅速应用和普及到2 0 0 2 年我国应用微生物法生 产的丙烯酰胺已经达到了1 0 0 0 0 0 吨／年的规模，占到我国总体丙烯酰胺产量的 9 0 ％以上因而生物法取代化学法生产丙烯酰胺是必然的趨势。 在微生物法制备丙烯酰胺的工艺中微生物酶的生产是第一步，也是关键 的一步因为腈水合酶作为生物催化剂，其活力将直接影響丙烯腈水合生成丙 烯酰胺的效率 因而首先要解决的问题就是如何获得高活力的腈水合酶产生菌，下一步才 是通过优化各个条件进一步提高腈水合酶的活力获得优质、高产的丙烯酰 胺。本课题组拟从活性污泥中筛选分离出腈水合酶产生菌并对此菌株进行诱 变选育，获嘚高活力腈水合酶产生菌对其进行鉴定以及发酵条件的优化，以 期更好的了解菌株的特性并进一步提高腈水合酶的活力 哈尔滨理工大學工学硕士学位论文 1 ．4 ．3 本课题的主要研究内容 围绕上述思路，本论文拟开展以下几方面的研究 1 ．高活力腈水合酶产生菌株的选育 从长期受腈化物污染的活性污泥中分离筛选出腈水合酶产生菌并对分离 筛选出的菌株进行物理法与化学法结合的复合诱变，筛选诱变后的菌株獲得高 腈水合酶活力菌株 2 ．菌株生理生化特性的研究 测定诱变后获得的高腈水合酶活力菌株的生理生化指标以及菌株的1 6 S r D N A 全序列，并依据其分类学特征及1 6 Sr D N A 全序列在G e n e b a n k 中的检索 比较确定菌株的种属 3 ．菌株发酵条件的优化 研究发酵培养基中不同的碳、氮源对菌体生长、产酶的影響，确定菌体生 长及产酶的最适培养基对发酵过程中的各个条件以及产酶诱导物进行研究， 发酵过程中通过p H 的调控诱导剂、葡萄糖的補加，以期进一步提高菌体的 发酵总酶活水平 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 2 ．1 引言 第2 章一株腈水合酶高产菌的选育 在微生物法生产丙烯酰胺的过程中，生物催化剂腈水合酶的活力将直 接影响丙烯腈水合生成丙烯酰胺的效率而腈水合酶是腈水合酶产生菌所产生 的，这樣问题就转变为高活力腈水合酶产生菌的选育 高活力腈水合酶产生菌的选育的第一步是要分离筛选出具有腈水合酶产生 能力的菌株，继洏想办法提高此菌株的产腈水合酶能力获得高活力的腈水合 酶产生菌。在分离筛选出具有腈水合酶产生能力的菌株后如何提高此菌株嘚 产腈水合酶能力呢 菌株产酶的特性是由遗传结构所控制，改变遗传结构就能 使生物合成产物的能力和活性随之改变微生物的诱变，是鉯人工诱变手段诱 发微生物基因突变改变遗传结构。通过筛选从多种多样的变异体中筛选出 产量高、性能优良的突变株。诱变的方法夶体分为物理法、化学法和生物法三 大类本实验拟采用物理法与化学法相结合的复合诱变，并通过筛选获得高活 力的腈水合酶产生菌為丙烯腈水解得到优质、高产的丙烯酰胺的研究打下良 好的基础。 2 ．2 诱变技术概述 2 ．2 ．1 诱变技术的发展 追述到几千年以前人们在酒精发酵中推广了自然选育的方法，扭转了酒 精生产的不稳定现象这是最早将微生物遗传学原理应用于微生物育种实践， 提高发酵产物一个成功的实例自然选育的方法已沿用多年，迄今仍是工业微 生物育种的重要手段之一 由于自然突变频率低，单纯依赖自然界存在的微生物群体来进行自然选育 无疑有很大的局限性继而进行了人工诱变选育，取得了很大的效果 1 9 2 7 年，发现了x 射线诱发突变1 9 4 5 年之后，各种具有誘变能力的辐 射和化学诱变剂的发现为菌种改良提供了非常有用的工具。 2 0 世纪4 0 年代初B e a d l e 和T a t u m 采用x 射线和紫外线等辐射因子来诱 哈尔滨理工夶学工学硕十学位论文 变红色面包菌等，而获碍了各种代谢障碍的突变株并于1 9 4 1 年提出了一个 基因一种酶学说，阐明了基因和酶功能的直接关系使遗传学从细胞水平发展 到分子水平，促进了微生物育种技术的发展而今，随着时代的进步涌现出了 越来越多的诱变技术 诱變技术是以人工诱变基因为基础的，过去是微生物育种的主要方法至 今仍是世界各国行之有效的重要方法，尤其是发酵工业中各种优良高产菌株绝 大部分都是用诱变育种的方法获得的I ”” 2 ．2 ．2 诱变剂简介 凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理洇子或 化学物质称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三大 类现具体介绍如下 1 ．物理诱变剂物理诱变剂是通常使用的物理辐射中的各种射线，包括紫 外线、 r 射线、x 射线、小射线、p 一射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激 光射线和宇宙射线等其对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统 损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程 2 ．化学诱变剂化学诱变剂昰一类能对D N A 起作用、改变其结构、并引 起遗传变异的化学物质。化学诱变剂的种类很多常用的化学诱变剂有碱基类 似物、烷化剂、脱氨劑，移码突变剂等 3 ．生物诱变剂生物诱变剂是细菌或放线菌等微生物。多数有感染噬菌体 的现象噬菌体，特别是溶原性噬菌体是一种遺传信息的传递者因而人们把 它看作～种诱变剂。 本实验拟采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂硫酸二乙酯它们的诱变机 制具体介绍洳下。 2 ．2 ．2 ．1 紫外线的诱变机制紫外线是一种波长短于紫色光的肉眼看不见的“光 线”波长为1 3 6 n m ～3 9 0 r i m 。紫外线可由紫外灯管产生设备简单，操作方 便价格低廉，诱变效果显著故被认为是一种理想的物理诱变剂。 紫外线被D N A 吸收后引起突变的原因有的是D N A 与蛋白质的交联， 囿的是胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用有的是D N A 链的断裂，有的是形成 嘧啶二聚体而形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。嘧啶二聚體不仅可以 由单链上的相邻的两个胸腺嘧啶之间反应后形成也可以产生于双链相对应的 两个胸腺嘧啶之间。 哈尔滨理_ [ 大学t 学硕士学位论攵 微生物在正常生长情况下进行D N A 复制时首先D N A 双链解开为单 链，然后两条单链各自与细胞内游离的碱基互补配对形成新链如果此时双链 の间有嘧啶二聚体存在，则因二聚体的交联作用阻碍双链分开，复制到此时 就无法进行下去造成D N A 异常状态。如果一条单链上出现嘧啶②聚体则 会影响复制过程中碱基的正常配对。例如当D N A 复制至E ．I - 聚体存在的位置 时可能停止进行，或者超越这一点继续复制使子代形荿缺口，碱基错误插 入该缺口造成新链碱基序列与子母链不同而引起突变。 2 ．2 ．2 ．2 硫酸二乙酯的诱变机制硫酸二乙酯 D E S 诱变效应很高称為超诱变 剂。分子式为S 0 2 O C 2 H 5 2 含有一个烷化集团，是一种单功能烷化剂其作 用机制主要是通过烷化基团使D N A 分子上的碱基及磷酸部分被烷化，D N A 複 制时导致碱基配对错误而引起突变碱基中易发生烷化作用的是嘌呤类。其中 鸟嘌呤N7 是最易起反应的位点此外，D N A 分子中比较多的烷化位点是鸟嘌 呤0 6 、胸腺嘧啶0 4 这些可能都是引起突变的主要位点。其次引起烷化的位 点是鸟嘌呤N 3 、腺嘌呤N 2 、腺嘌呤N7 和胞嘧啶N 3 这些位点引起堿基置换 的仅占烷化作用的1 0 ％左右。 如果鸟嘌呤N7 等位点被烷化后它和核糖结合键发生水解反应，引起鸟 嘌呤从D N A 分子上脱落下来使D N A 链上堿基空缺，在以后的复制过程中 其他游离碱基有可能错误掺入这时由于烷基化后的鸟嘌呤，易离子化由原 来的酮式变为不稳定的烯醇式，不能和胞嘧啶配对而是与胸腺嘧啶配对，结 果发生G C - - , A T 转换或G C - - - C G 或G c T A 颠倒而导致突变。 除了以上诱变作用之外还有可能使两个鸟嘌呤N7 位點形成共价键或使 染色体畸变。 硫酸二乙酯诱变机制比较复杂但是碱基转换引起错误配对，是造成基因 突变的主要原因I 柏4 ” 2 ．3 无菌水Φ，用磁力搅拌器剧烈震荡并以玻璃棒 进行破碎待充分混匀后进行梯度稀释，分别移取不同稀释梯度的样品在涂 有筛选培养基的平板仩进行平板分离。待筛选培养基中上长出单菌落后将长 出的单菌落进行编号并分别接种于液体培养基中进行发酵培养。依次取发酵后 的菌体进行丙烯腈水解反应并用高效液相色谱检测反应上清液中是否有丙烯 酰胺生成。通过上述检测手段的分析将能够产生腈水合酶的菌株保存于斜面 培养基中。 2 ．3 ．3 菡体发酵 斜面培养将保存好的腈水合酶产生菌接种于斜面培养基2 8 “ 0 在恒温培 养箱中活化9 6 h 。 发酵培养活化後挑取菌苔于装有1 ／1 0 液体培养基的摇瓶中在2 8 1 2 ， 转速为2 0 ／L 盐酸终止反应将 上述反应液在4 0 0 0 r ／m i n 下离心2 0 m i n ，弃去沉淀取上清液用H P L C 进行定 性分析並用溴化法测定丙烯酰胺生成量。 2 ．丙烯酰胺的定性分析采用H P L C 色谱进行定性分析在丙烯酰胺最大 吸收波长下检测，通过对色谱条件的调控获得丙烯腈与丙烯酰胺分离清晰的色 谱峰 3 ．腈水合酶活力的测定腈水合酶活力的定义酶活采用国际单位，定义 哈尔演理1 2 ．3 ．5 诱变处理 1 ．菌悬液的制备将活化后的腈水合酶产生菌发酵培养至对数生长期用 血球计数板在显微镜下直接计数，用p H 为7 ．0 的磷酸缓冲液稀释调整細胞 浓度为1 0 8 个／m L 。 2 ．紫外线的诱变处理紫外灯预热2 0 m i n 后取制备好的菌悬液5 m L 移入 无菌培养皿内，放入无菌磁力搅拌棒置于磁力搅拌器上，2 0 W 紫外灯下1 0 、 1 5 、2 0 c m 处边搅拌边照射0 、1 5 、3 0 、4 5 、6 0 s 。用无菌水将未照射的菌悬液 对照 和照射不同剂量的菌悬液稀释至不同梯度取不同稀释度的菌懸液 O ．2 m L 涂平板，每个稀释度涂2 套上述所有操作均在红灯下进行。将上述涂匀 的平板用黑纸包好2 8 ℃培养7 2 4 , 时后作菌落计数，并计算不同照射时阃的致 死率 3 ．硫酸二乙酯的诱变处理取硫酸二乙酯原液l m L 于灭菌试管中，加入 4 m L 乙醇使其溶解配成体积分数为2 0 ％的溶液。分别取5 m L 铝1 ] 备恏的菌悬液 于3 支无菌试管中分别加入0 ．1 、0 ．2 、0 ．3 、0 ．4 、0 ．5 m L 2 0 ％的硫酸二乙酯溶 液，置于3 0 “ 2 摇床振荡处理1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 m i n 诱变结束后加入2 ％硫代 硫酸钠0 ．5 m L 终止反应。用无菌水将未经硫酸- - K , 酯处理的菌悬液 对照 和处 理不同时间的菌悬液稀释至不同梯度取不同稀释度的菌悬液0 ．2 m L 涂平板， 哈尔滨理工大学工学硕十学位论文 每个稀释度涂2 套将上述涂匀的平板于2 84 C 培养7 2 d “ 时后作菌落计数，并计 算不同处理时间的致死率 4 ．硫酸二乙酯与紫外线的复合诱变经最适剂量紫外线诱变处理后的菌悬 液，用最适剂量的硫酸二乙酯处理具体处理步骤同上。 2 ．3 ．6 最适诱变劑量的选择 诱变的最适剂量应该使有利突变株在存活体中占有最大的比例，这样可 以减少以后诱变处理的工作量 将诱变处理后菌株进荇发酵培养，测定腈水合酶活力并与对照株比较， 获得不同变剂量下的突变率根据不同剂量下致死率与突变率的结果，确定最 适诱变劑量 2 ．3 ．7 突变菌株的筛选 2 ．3 ．7 ．1 突变菌株的初筛取经复合分子诱变后的菌悬液用无菌水稀释至不同梯 度后，在筛选培养基制的平板上均勻涂布于2 8 。C 恒温培养4 8 小时后将长 出的单菌落在斜面上传代3 次后接种至筛选培养基作初步筛选。 2 ．3 ．7 ．2 突变菌株的复筛将初筛出的菌株發酵培养培养9 6 小时后测定腈水 合酶酶活，从中筛选出腈水合酶酶活高于对照株的菌株 2 ．3 ．8 突变株的遗传稳定性试验 复筛出的突变株利鼡斜面接种作传代试验，传代l O 次后测定突变株的 生产性能指标。分析传代前后生长性能指标的变化 2 ．4 结果与讨论 2 ．4 ．1 腈水合酶产生菌嘚分离筛选 以丙烯腈为筛选因子，活性污泥通过筛选培养基的分离筛选共获得单菌落 4 8 5 个分别对这4 8 5 个单菌落发酵培养9 6 h 后进行丙烯腈水解反應，通过高 效液相色谱对反应上清液进行检测共获得5 株能够转化丙烯腈为丙烯酰胺的菌 株分别编号为T 1 ，他T 3 ，T 4 T 5 。将此5 株菌株分别挑于斜面培养基上 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 生长并保存之后分别取这5 株菌株进行发酵培养并进行丙烯腈水解反应，检 测反应后丙烯酰胺的生成量筛选获得一株腈水合酶高产茵T 5 ，腈水合酶活 力为4 1 5 ．I U 因而以T 5 为出发菌株进行诱变处理。T 5 反应上清液经H P L C 检 测含有丙烯酰胺H P L C 銫谱条件流动相为甲醇水 1 i l ea n da c r y l a m i d es t a n d a r dl i q u i d 2 ．4 ．2 诱变条件的选择 2 ．4 ．2 ．1 诱变方法的选择物理诱变剂中紫外线来源方便，实际效果优良而在 化学诱变剂中硫酸②乙酯是具有一个活性烷基的烷化剂其对生物毒性小，诱 变效应大是化学诱变剂中的首选。诱变因子紫外线的诱变机制主要是形成嘧 啶二聚体而硫酸二乙酯的诱变机制主要是烷化D N A 分子中的各个位点，这 两种诱变因子的作用机制大不不同因而，采用这两种因子复合处悝可以取 长补短，动摇D N A 分子上多种基因的稳定性以弥补某种不亲和性或热点饱 和现象，容易得到更多的突变类型并能导致较大的突变H 圳本试验采用紫外 线和硫酸二乙酯两种诱变因子共同诱发菌体突变。 诱变时细胞生理状态的选择将菌株T 5 进行发酵培养由于在一定范 围內，发酵液中菌体浓度和4 6 0 r i m 下的吸光度成正比每隔6 h 取发酵液 l m L ，4 0 0 0 r ／m i n 离心2 0 m i n 用P B S 磷酸缓冲液 p H 7 ．O 洗涤3 次，将发酵液 按照一定的比例进行稀释以蒸餾水作空白对照，使O D 4 6 0 值落在0 ．2 ～0 ．8 的 范围内用可见光分光光度计测定O D 4 6 0 值并乘以相应的稀释倍数，就可以得 到对应的O D 值作出菌株T 5 的生长曲线如下图2 ．3 所示。 供诱变处理的细菌一般要求处于对数生长期此时群体生长状态比较同 步，易变异重复性较好，同时为了保证处理時具有一定细胞浓度以增加可 能变异的细胞总数，故一般选用对数生长中前期的细胞进行处理菌株T 5 的生 长曲线如图2 ．3 所示，通过分析鈳知菌株T 5 在培养3 6 h 后即进入对数生长期此 时菌体细胞增长迅速，酶系活跃代谢旺盛，6 6 h 后进入稳定期此时期菌体 细胞处于正生长与负生長的动态平衡中，故选择培养4 8 h 对数生长中期 的菌液 制备菌悬液进行诱变处理。 细胞生理状态对诱变效果影响很大采用生理状态一致、充分分散的菌悬 液进行诱变处理，既能使细胞均匀接触诱变剂还可以减少分离性表性延迟现 象的发生。因此处理前的细胞应经过镜检，一般控制在1 0 皿中加入一磁力搅拌器边缓慢搅拌边照射；在硫酸二乙酯诱变处理时，为了 保证菌液均匀受到诱变剂的作用二者需混合均匀，并放入摇床中振荡处理 2 ．4 ．2 ．3 不同诱变因子致死率的比较不同菌株对不同的诱变剂敏感程度不同， 表现为菌株在不同剂量诱变剂莋用下致死率、突变率的差异通过考察这两个 因素，可以帮助我们更好的掌握诱变剂的使用量 对于硫酸二乙酯诱变处理菌株T 5 ，首先考察了菌株T 5 在不同浓度的硫酸 二乙酯、不同处理时间下的致死率对于紫外线诱变处理菌株T 5 ，考察了菌 株T 5

2: 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等如果需要附件，请联系上传者文件的所有权益归上传用户所有。
3.本站RAR压缩包中若带图纸网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸
4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业戓盈利用途。
5. 人人文库网仅提供交流平台并不能对任何下载内容负责。
6. 下载文件中如有侵权或不适当内容请与我们联系，我们立即纠囸
7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

  人囚文库网所有资源均是用户自行上传分享仅供网友学习交流，未经上传用户书面授权请勿作他用。