干酪乳杆菌Lc18锰超氧化物歧化酶基因的克隆和异源表达--《上海交通大学》2010年硕士论文
干酪乳杆菌Lc18锰超氧化物歧化酶基因的克隆和异源表达
【摘要】：
乳杆菌是人和动物体内十分重要的益生菌群之一,肩负着许多重要的生理作用,其中包括对宿主的抗氧化效应。益生菌产品也得到了越来越广泛的研究和应用。其中益生菌的抗氧化性能是最重要的益生指标之一,具有重要的研究价值。
乳杆菌有许多种抗氧化的机理,如超氧化物歧化酶(SODs),过氧化氢酶以及细胞内高浓度的金属离子等等。超氧化物歧化酶是生物体内清除活性氧自由基的一种重要酶类,是生物体抗氧化能力的一个重要依据。目前,许多生物体内的sod基因都得到了广泛的研究,并在各种载体中完成了异源表达。但迄今为止,乳杆菌中的sod基因仍然尚未有人研究。据之前的研究报道,大部分的乳杆菌中都不含sod基因,仅有两株乳杆菌(干酪乳杆菌和米酒乳杆菌)在经过全基因组测序后,从生物信息学的角度判断其可能含有sod基因,但至今还没有人将乳杆菌中可能含有的sod基因进行克隆和异源表达,从实验上加以证明。
在本研究中,我们首先对6株乳杆菌进行了抗氧化能力的评价,首先选取抗氧化能力最佳的干酪乳杆菌Lc2作为sod基因供体,但经过反复PCR均未产生特异性结果。实验中所使用的引物均是根据已经全测序的标准菌株干酪乳杆菌ATCC 334的序列进行设计,而Lc2的sod基因在进化过程中与标准菌株发生了较大的差异;或其基因组根本不含sod基因,而其仍能保持较高的抗氧化水平可能是由于体内具有较高的金属离子浓度或其他机理。之后我们以干酪乳杆菌Lc18为材料,根据干酪乳杆菌ATCC 334的全测序结果,设计引物并摸索出了适宜的扩增条件,成功获得了干酪乳杆菌Lc18的sod基因,并利用pET表达系统,将目的片段双酶切,连接pET-28a(+)质粒,转化DH5α扩增重组质粒,并将提取重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌。经过重组菌液PCR检验及重组质粒酶切检验,证明目的片段已经插入pET-28a(+)质粒中,且成功转入宿主菌内。最后,经过IPTG诱导,通过重组菌粗蛋白提取液SDS-PAGE电泳,我们在目标位置得到了条带,初步说明重组质粒在宿主菌中得到了表达。随后,我们使用Ni-NTA系统对粗蛋白进行亲和纯化,得到目标蛋白SOD,使用SDS-PAGE进行检验得到单一的目标条带,并测得纯化蛋白酶的活性为39.97 U/mg。
我们对重组菌进行了氧化性评价,其氧化性有一定的提高,尤其是超氧阴离子清除率和过氧化氢清除率。而提高的程度并不高,可能是由于宿主菌E. coli BL21(DE3)本身亦含有SOD蛋白,导致本底水平较高的缘故。而同时我们也发现粗蛋白提取液的抗氧化性普遍高于完整细胞的抗氧化性,这一发现与Saide和Gilliland之前所发表的文献中发现一致。可能的原因是胞质中抗氧化酶类或物质能更好的接近氧化底物。此外我们通过N端氨基酸序列分析,判断该SOD蛋白为含有金属离子锰的超氧化物歧化酶。
本文是首篇将乳杆菌中的sod基因扩增出来并进行原核异源表达的研究。通过未经全测序的干酪乳杆菌Lc18菌株的sod基因在大肠杆菌中的原核表达,首次从乳杆菌属中克隆出sod基因,直接证明了干酪乳杆菌Lc18中存在sod基因。证明了该sod基因能够异源表达并能在异源生物中产生活性,纯化分离的SOD蛋白也具有一定的酶活。并利用N端氨基酸序列的方法推测出干酪乳杆菌Lc18中SOD蛋白属于MnSOD。
【关键词】：
【学位授予单位】：上海交通大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：Q78【目录】：
ABSTRACT7-12
第一章 前言12-25
1.1 益生菌概述12-16
1.1.1 益生菌定义12
1.1.2 适用于益生菌制品的菌株12-14
1.1.3 益生菌的益生性14-16
1.2 益生菌与抗氧化性16-18
1.2.1 生物氧化概述16
1.2.2 自由基及自由基清除的基本概念16-17
1.2.3 益生菌的抗氧化作用17-18
1.2.4 益生菌的抗氧化机制18
1.3 超氧化物歧化酶18-22
1.3.1 抗氧化酶类18
1.3.2 SOD 概述18-19
1.3.3 SOD 分类比较19
1.3.4 SOD 的分布和定位19-20
1.3.5 SOD 的应用前景20-22
1.4 干酪乳杆菌22-25
1.4.1 干酪乳杆菌概述22-23
1.4.2 干酪乳杆菌的益生功能23-24
1.4.3 干酪乳杆菌与SOD 酶24-25
第二章 课题的研究意义和研究方案25-28
2.1 研究意义25-26
2.2 研究方案26-28
第三章 几株乳杆菌抗氧化性评价28-40
3.1 仪器、试剂与材料28-30
3.1.1 实验仪器28-29
3.1.2 主要药品和试剂29-30
3.1.3 实验菌株30
3.2 实验方法30-33
3.2.1 菌种活化和保藏30-31
3.2.2 革兰氏染色和形态观察31
3.2.3 生长曲线测定31-32
3.2.4 乳杆菌完整细胞及无细胞提取液制备32
3.2.5 超氧阴离子清除率评价方法32
3.2.6 过氧化氢清除率评价方法32-33
3.2.7 脂质过氧化物清除率评价方法33
3.3 结果与讨论33-40
3.3.1 乳杆菌生长曲线33-36
3.3.2 6 株乳杆菌抗氧化性评价36-40
第四章 目的sod 基因获取40-51
4.1 仪器、试剂和材料40-41
4.1.1 实验仪器40
4.1.2 主要药品与试剂40-41
4.1.3 实验菌株41
4.2 实验方法41-46
4.2.1 基因组DNA 的提取与纯化42
4.2.2 sod 基因片段扩增42-43
4.2.3 凝胶电泳43-44
4.2.4 DNA 片段的纯化44-45
4.2.5 感受态细胞制备45
4.2.6 连接pMD19-T 载体克隆测序45-46
4.3 结果与讨论46-51
4.3.1 16s rDNA 测序菌株鉴定46-47
4.3.2 引物设计及PCR 扩增47-49
4.3.3 PCR 产物测序鉴定49-51
第五章 sod 基因转化宿主菌51-60
5.1 仪器、试剂和材料51-52
5.1.1 实验仪器51
5.1.2 主要药品与试剂51-52
5.1.3 实验菌株52
5.2 实验方法52-56
5.2.1 空质粒扩增与抽提52-53
5.2.2 质粒与目的基因酶切、连接及转化DH5α53-54
5.2.3 pETsod 重组质粒转化DH5α54-55
5.2.4 重组质粒电转化大肠杆菌BL21(DE3)55-56
5.3 结果与讨论56-60
5.3.1 DH5α阳性克隆子检验56-57
5.3.2 重组质粒双酶切检验57-58
5.3.3 重组质粒电转化BL21(DE3)检验58-60
第六章 重组菌蛋白诱导表达、纯化、鉴定和酶活检测60-72
6.1 仪器、试剂和材料60-62
6.1.1 实验仪器60-61
6.1.2 主要药品与试剂61-62
6.1.3 实验菌株62
6.2 实验方法62-68
6.2.1 重组菌诱导表达及粗蛋白提取62-63
6.2.2 SDS-PAGE 钠十二烷基的硫酸盐(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳法63-64
6.2.3 Ni-NTA 蛋白亲和纯化64-65
6.2.4 蛋白浓度及活性测定65-68
6.3 结果与讨论68-72
6.3.1 重组菌诱导表达，粗蛋白提取物SDS-PAGE 检验68-69
6.3.2 Ni-NTA 亲和纯化和SDS-PAGE 检测69-71
6.3.3 纯化SOD 蛋白活性测定71-72
第七章 重组菌抗氧化性评价72-78
7.1 仪器、试剂与材料72-74
7.1.1 实验仪器72-73
7.1.2 主要药品和试剂73-74
7.1.3 实验菌株74
7.2 实验方法74-75
7.2.1 大肠杆菌完整细胞及无细胞提取液制备74
7.2.2 超氧阴离子清除率评价方法74-75
7.2.3 过氧化氢清除率评价方法75
7.2.4 脂质过氧化物清除率评价方法75
7.3 结果与讨论75-78
第八章 SOD 氨基酸序列对比分析78-81
8.1 实验材料78
8.2 结果与讨论78-81
第九章 结论、展望和创新点81-84
9.1 结论81-82
9.2 创新点82-84
参考文献84-89
攻读硕士学位期间已发表或投稿的学术论文90-92
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