人朊蛋白不同N-糖基化修饰突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达--《生物工程学报》2006年03期
人朊蛋白不同N-糖基化修饰突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达
【摘要】：构建并表达人朊蛋白N-糖基化修饰位点突变的真核表达载体,有助于进一步研究朊蛋白N-糖基化修饰的生物学功能。定点突变野生型人朊蛋白基因PRNP,将获得的突变体亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,并在人宫颈癌细胞株HeLa中瞬时表达各种朊蛋白糖基化修饰位点突变体,利用免疫印迹和糖苷酶消化等糖蛋白分析方法鉴定表达产物的糖基化形式。经Western blot鉴定,野生型和突变型朊蛋白表达产物出现不同形式的泳动特征,分别出现特异性糖基化修饰的多个条带,单糖基化修饰的两条条带和无糖基化修饰的一条条带。经PNGase F糖苷酶消化,野生型和糖基化单点突变型表达产物均能被糖苷酶消化,其分子量下移,去糖基化
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：Q78【正文快照】：
朊病毒病(Prion diseases)是由朊病毒(Prion)引起的人和动物的一组具有共同特征的亚急性、渐进性、致死性中枢神经系统退行性疾病[1,2]。1982年Stanley Prusiner提出朊病毒病的病因是由正常体内细胞朊蛋白(PrPC)发生改变转化为异常构象的朊蛋白(PrPSc)[3-5]。糖基化是蛋白质
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京公网安备74号人IgG1-Fc在昆虫表达系统中N-糖基化修饰的研究--《江苏科技大学》2011年硕士论文
人IgG1-Fc在昆虫表达系统中N-糖基化修饰的研究
【摘要】：昆虫杆状病毒表达系统能够对表达的重组糖蛋白进行N-糖基化修饰,具有潜在的表达高等哺乳动物N-糖基化修饰的功能蛋白的前景。该系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力,包括糖基化、磷酸化、信号肽切除及肽段的切割和分解等,修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况一致。对比实验证明,在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致,但修饰的寡糖种类不完全一样。这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同,所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。
人IgG1是人体内非常重要的免疫球蛋白,其免疫功能与N-糖基化修饰有很大的关系。本课题利用昆虫杆状病毒表达系统表达了人IgG1中需要N-糖基化修饰的Fc片段。实验结果表明人IgG1-Fc在昆虫病毒系统得到较高水平的表达,通过糖苷酶PNGase F处理经Protein A纯化柱纯化的人IgG1-Fc,结果显示人IgG1-Fc的N297糖基化位点发生了N-糖基化修饰。这不仅有助于研究昆虫细胞糖基化机制,同时也为改造昆虫病毒表达系统来表达具有医学价值的糖蛋白奠定了坚实的基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：江苏科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：R346【目录】：
摘要6-7Abstract7-13第1章 绪论13-27 1.1 研究背景和选题意义13-25
1.1.1 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统13-15
1.1.2 昆虫和哺乳动物糖蛋白的N-糖链修饰异同15-18
1.1.3 免疫球蛋白IgG 的基本结构18-20
1.1.4 人IgG1-Fc 糖基化的生物学功能20-22
1.1.5 糖蛋白的糖链结构分析技术22-24
1.1.6 理论意义和实用价值24-25 1.2 课题的主要内容25-27第2章 人IgG1-Fc 在昆虫表达系统中的表达与纯化27-50 2.1 引言27 2.2 材料与方法27-39
2.2.1 实验材料27-32
2.2.2 实验方法32-39 2.3 结果与分析39-47
2.3.1 人IgG1-Fc 基因的扩增39
2.3.2 重组质粒FC-T 的鉴定39-40
2.3.3 人IgG1-Fc 基因的序列及其分析40-42
2.3.4 重组表达载体SP-Fc-P 的构建42-43
2.3.5 重组SP-Fc-B Bacmid 的抽提与鉴定43-45
2.3.6 重组杆状病毒的鉴定45
2.3.7 Western blotting 对人IgG1-Fc 蛋白的检测45-46
2.3.8 人IgG1-Fc 蛋白的纯化46-47 2.4 讨论47-48 2.5 本章小结48-50第3章 人IgG1-Fc 蛋白的N-糖基化鉴定50-58 3.1 引言50-51 3.2 材料与方法51-55
3.2.1 实验材料51-54
3.2.2 实验方法54-55 3.3 结果与分析55-56
3.3.1 PNGaseF 对人IgG1-Fc 蛋白的N-糖基化鉴定55-56 3.4 讨论56 3.5 本章小结56-58第4章 人IgG1-Fc 蛋白的糖链结构分析58-64 4.1 引言58-59 4.2 材料与方法59
4.2.1 实验材料59
4.2.2 实验方法59 4.3 结果与分析59-62
4.3.1 人IgG1-Fc 蛋白的糖链结构分析59-62 4.4 讨论62-64结论64-66参考文献66-70攻读学位期间发表的学术论文70-72致谢72
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