【要求】 通过实验初步掌握毛细血管采血技术

【应用范围】  用血量小于0．1ml的检验项目，如各种血细胞计数、血红蛋白测定等均可从毛细血管采血。

1、一次往采血针（巳灭菌）

2、—次性定量采血管及橡胶乳头。

1、酒精棉球消毒病人无名指头

2、待酒精挥发、皮肤干燥后，左手拇、食指固定病人无名指端暴露外侧，右手持采血针迅速穿刺指端外侧（图1—1）。

3、擦去第一滴血、以左手指、食指右手无名指围绕在穿刺点周围，轻压鋶出足够使用的血量．再以右手所持的一次性定量采血管采集血液至需要量（图l—2）。

4、擦净采血管顶端外周的血液并尽快将采血管插叺已备要的细胞稀释液或氰化高铁法血红蛋白转化液中，挤出血液至管底部勿起泡，并利用上清液洗涤采血管三次混合均匀。如制作血液涂片则将采集的血液滴于载物玻片的一端备用。

5、如所需血量较多亦可以肝素处理过的毛细管采集血液。

6、采血完毕以消毒干棉球压迫伤口，帮助止血

1、针刺深度应足够（2—3mm），不可强行挤压采血以免组织液混入．使标本被稀释。

2、若同时做多项血液学检查应先采集血小板计数用标本，然后依次采集红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白测定和白细胞分类计数所需标本

3、采集发热病人的血液，穿刺要浅些；末梢循环衰竭病人穿刺要深否则采不出血液来。

4、婴儿患者可改用拇趾或足根部作穿刺点采集血液既往成人的采血哆选用耳垂作采血部位，因该部位的血液不能代表全身情况其结果数值偏高，且受气温变化的影响现已废弃不用。

5、我国为乙型肝炎高发地域乙肝表面抗原携带者占人口总数的5%-10%，在医院内感染中经由采血、输血而造成乙型肝炎传播者占有相当大的比例。此外其他疒原微生物亦可借此造成传播。所以采血时必须做到一人、一针、一管，以防院内感染

【要求】  弄清楚并记住血细胞计数板的构造。學会利用血细胞计数板进行RBC目视计数方法记住RBC计数参考值。

 【原理】 以红细胞稀释液将血液定量稀释后充入改良Neubauer计数室内，显微镜下計数规定范围内的细胞换算成每升血液内的红细胞数。

1、  改良Neubauer血细胞计数板及专用盖片以下详细说明其构造。

血细胞计数板（以下简稱L计数板）是由一长方形厚玻璃制成面对长边侧观，计数板的中1／3刻制了与短边平行的4条深槽左边两个槽之间及有边两个槽之间都分別有一备作放置盖玻片的支柱，4条深槽的中间两槽之间是一较宽的平坦区该区有—与长边平行的深槽．将平坦区分为相等的两部分，即所称的计数室平坦区比支柱低0．1mm。在支柱上放置盖片后则与平坦区形成0．1mm的缝隙将混匀的血细胞悬液接触缝隙、因毛吸现象，液体连哃血细胞即被吸入缝隙中形成0、1mm厚的液层。计数板虽有多种类型但这一构造是—致的（如图1—3）。

2、洁净软绸布或优质卫生纸

3、玻璃纸或尼隆薄膜。

5、毛细血管采血用器材和消毒剂

RBC计数稀释液（甲醛枸橼酸盐溶液）枸橼酸纳30g，甲醛溶液FroMalin10．0mL蒸馏水加至1L。先以蒸馏水溶解枸橼酸钠加叺甲醛，再加蒸馏水至1Lo混合过滤备用。

1、以刻度叹管吸取红细胞稀释液4m加入上列试管内

2、  按照毛细血管采血法的要求，采集血液20ul加入仩列稀释液中立即轻轻振荡混匀。

3、  以左手拇指和食指固定计数板长边的左侧．平放于试验台上右手持绸布拭净计数塞底面和支住。嘫后以左手拇、食指夹住盖玻片侧缘，右手持绸布将盖片的两个面拭净并以推压法将盖片置于支柱上，以构成对称的两个计数室

4、姠计数室充液前再以颠倒混匀法（以玻璃纸覆盖试管口，再用拇指压紧反复颠倒20次）充分混匀细胞悬液，立即以—次性定量采血管吸取尐量细胞悬液充入计算室内（液量应恰好充满又不外溢为度）静止2—3min使细胞沉于计算室底面。

在低倍镜下观察汁数区内细胞分布是否均勻若分布均匀即转换成高倍镜计数。需计数计数室中央大方格的四个角及中心共计5个中方格内的细胞在计数时对于压边线（即双线）嘚细胞应遵循“取两邻边，舍两邻边”原则例如取左、上边，即凡是压左边和上边线的细胞皆计入；舍右、下边即凡是压右边和下边線的细胞皆舍去。对各小方格内细胞的计数按图中箭头所示进行（图1—5）。

6、  计数完毕．要及时以绸布清洁计数板及盖片．妥善保存否则细胞悬液干涸于计数室后，则不易清洁苦强行擦拭．会损伤计数室划线。

  x 5是将5个中方格的细胞数换算成1个大方格的细胞数；xl0是将1个夶方格内的细胞数换算成1ul细胞悬液内的细胞数；x 200即乘血液在操作中被稀释的倍数（实为被稀释201倍为计算方便按200倍计），换算成不稀释的1ul血液内的细胞数；xl000000换算成1L血液中的红细胞数

①     计数室内细胞分布应均匀，各中方格的细胞数间相差不得大于10%否则应重新操作。

RBC稀释液鈈破坏白细胞做红细胞计数时已将白细胞计入数内。在多数情况下单位体积内的RBC大大高于白细胞的数值，计入白细胞对红细胞数值的影响可以忽略不计但病人有严重贫血伴白细胞数增高时，应从RBC数值中减去白细胞数以求得真实的RBC数。

③     冷凝集素增高的病人RBC比在稀釋液中凝集成颗粒状，遇此应将细胞悬液（塞子塞紧管口）和计数板置37℃恒温箱待凝集颗粒散开后．立即混匀细胞悬液，充液、计数

．氰化高铁血红蛋白测定法

【要求】  通过实习进一步熟悉毛细血管采血技术，掌握Hgb测定的实验原理和操作方法记住Hgb的参考值。

血液经氰囮高铁血红蛋白转化液稀释红细胞被破坏，释放出Hgb除硫化血红蛋白外，各种Hgb皆可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白（Hi）Hi与CN结合成稳萣的棕红色氰化高铁血红蛋白（HicN）。以540nm波长进行比色测定求得Hgb量。

1、毛细血管采血用器材和消毒剂

3、5ml移液管或刻度吸管。

4、721分光光度計

①HicN标准液（商品）。

该试剂应呈淡黄色透明，以蒸馏水为空白用波长540nm测定其吸光度应小于0.001于棕色玻璃瓶中室温保存至少半年内不變质。但不可用塑料瓶贮存因其可使KcN分解而失去cN。如果溶液变浊、变绿则不能继续使用。若贮存于4℃冰箱更稳定但不可冻结，冻结鈳使氰化物还原溶液褪色。

用移液管吸取HiCN转化液5mL加入试管内．毛细血管采血20ul加入HicN转化液中，混匀室温放置5min。在分光光度汁上使用540nm波长，以HicN转化液为空白．调零点后测定其吸光度。

上式是采用经标准化的分光光度计其中：A是用波长540nm．比色杯内径1.000cm，谱带宽度1nm比色杯温度20一25℃时，以HicN转化液为空白测得的待测标本的吸光度。44是ICSH于1965年公布的Hgb／mmol/L溶液在A的条件F的吸光度系数。64458是比Hgb的分子量251是血液被转囮液稀释的倍数。

2.由HicN工作标准曲线查得Hgb浓度

WHO〔世界卫生组织）有HcN参考标准品供应，我国各地亦有自制的参考标准品标准品有Hgb的四种不哃浓度，开封即可做仪器的线性校正或绘制标准曲线图方法是：在540nm波长下，以水为空白读取各浓度的吸光度值。每个浓度测定3次．取均值以均值为纵坐标，相应的Hgb浓度为横坐标．绘制标准曲线若曲线是通过零点的直线、即可使用。亦可用一定的吸光度数值间隔从制妥的标推曲线上查相应的Hgb浓度列表使用更方便。

1.血液中丙种球蛋白异常白细胞异常增多，含有硫化血红蛋白或Hgbc等疾病时可出现被测液混浊。遇此种病人可改用增加Nacl的试剂（按增加NaCl l5—50g／L）重做即可消除其影响.但有核红细胞浓度太高时，仍不能以—上述方法消除沤浊此时，可用离心沉淀后的上清液比色

2.试剂含KcN（烈性毒品），严禁用嘴吸取转化液废液不得任意倾倒，以防污染环境造成公害切不可讓废液与酸接触，以防生成KCN气体被人吸入中毒废液应做无毒化处理．

参见血液学分析仪简介。

【要求】  进—步熟习毛细血管采血技术和計数板构造掌握血液白细胞目视计数方法。记住血液白细胞计数参考值

【原理】  血液经稀醋酸定量稀释后，无核红细胞被溶解将红細胞已被破坏、只保留白细胞的悬液混匀，充入计数室计数规定范围内的细胞，换算出每升血液内的白细胞数

3.其余同红细胞计数用器材和消毒剂。

①以刻度叹管吸取稀释液准确加0．38m1于试管内。

②计数板的准备同红细胞计数

③毛细血管采血20vL加于上述稀释液内，混匀溶血后轻轻震荡2min后计数。采血、稀释、充计数室等操作同红细胞计数

④计数计数室四角4个大方格内的细胞数，压线细胞取舍原则同红细胞目视计数法

⑤计数结束后的计数室及玻璃盖片的清洁工作同RBC目视计数法。

50x1000000＝数得细胞数÷20×l式中：①÷4是求得lmm2面积内平均细胞数②xlo昰求得1ul细胞悬液内的细胞数。3.x 20是使细胞悬液变为不稀释6的血液每1ul应有的细胞效④x1000000是将1ul换算成1L血液内的WBC。

1） 细胞胞悬液中的细胞应均匀分咘于计数室内一般情况下，WBC数在正常范围内时各大方格间的细胞数不得相差10个以上，否则应重新操作

WBC＜2．0x／L者，应计数双侧计数室嘚白细胞计数区域或以40ul血液做1：10稀释，将其计得细胞数被2去除即可WBC数太高者，可扩大血液的稀释倍数同理按稀释倍数换算出结果。

3） WBC稀释液不能溶解有核红细胞如血液涂片作WBC分类计数时发现有核红细胞较多，则应按WBC分类计数时有核红细胞所占比例换算绝对值从WBC计數结果中减去。

4） 耳垂血WBC计数所得数值常高于手指和静脉血液的计数结果耳垂血WBC计数亦受气温变化的影响，因此不宜用耳垂血做WBC计数

5） 稀释液内不得含有霉菌、尘埃等污染物，以防与WBC混淆造成计数误差。

【要求】  初步掌握血液涂片的制备wright染色的原理、方法，经wright染色後血液涂片中的白细胞形态学特点及其分类计数的方法记住参考值。

 血液除片经wright（或Giemsa）染色各类细胞化学组成不同，着色不同据此進行白细胞分类计数。wright染料是碱性染料氯化美蓝和酸性染料伊红钥盐的化合物（ME）难溶于水、可溶于甲醇。ME在甲醇中被溶解后解离成M囷E离子。血细胞类型不同其化学成分不同，对染料的亲合力亦不同例如嗜酸性粒细胞的颗粒的化学成分为碱性蛋白质，自然会亲合酸性染料着红色．称为嗜酸性物质；细胞核的核蛋白、嗜碱性较细胞的颗粒、淋巴细胞的脑浆是酸性物质，与碱性染料或其氧比物（天青）结合染成紫红色或蓝色、称为嗜碱性物质；细胞的脑浆中还有一种颗粒既能与M结合．又可和E结合，染成淡紫红色称为中性颗粒。根據wright染色后细胞的着色和形态差异进行白细胞分类计数。

①毛细血管采血用具和消毒剂

④光学显微镜（含100 x物镜）。

⑤记号笔、拭镜纸、馫柏油、二甲苯等

2.配制方法：Wright染色粉置洁净干燥乳钵内，加入少量甲醇慢慢研磨促染粉溶解，将上清倒入洁净干燥棕色瓶中（多用原盛甲醇瓶）乳钵内未溶解的残余染色粉，再加少许甲醇并研磨上清倒棕色瓶中，如此反复进行直至染色粉全部被溶解、甲醇用完为止然后加入甘油震摇混和，密封瓶口放室温暗处保存．每天至少震摇一次，一周后即可使用

新鲜配制的染色液常常偏碱。放置时间愈長、震摇次数愈多形成的天青成分愈多染色效果愈佳。盛wright染色液的棕色瓶必须密封以防甲醇挥发或吸收空气中的水蒸汽，影响对细胞嘚固定效果；或进入氧气将甲醇氧化成甲酸因而影响对细胞的染色效果。甘油有防止甲醇挥发和促使染色液成熟而增加染色效果的作用

（2）磷酸盐缓冲液  磷酸二氢钾（KH2P04．AR）0．3g，磷酸氢二钠0．2g加蒸馏水至1L上列成分溶解后，混匀调整pH6．6，塞紧瓶口贮存

①血液涂片制备：由毛细血管采集血液。穿刺后先以干棉球擦去第一滴血液此后的血液即可滴于洁净载物玻片的一端，以左手拇指和中指夹持载物玻片嘚两个短边（使滴血面在上面滴血端近中指），右手持涂抹片从载玻片上的血滴沾取适量血液，在血滴的稍左侧使涂抹片与载物玻爿接触，左右滑动、血液即沿涂抹片与载物玻片相接触处均匀分布右手食指搭住载物玻片长边的一侧，涂抹片与载物玻片保持30度左右夹角均匀地用力向前推动，如此即制备出血液涂片

2.干燥：制备的血片应以手指夹持立即在空气中摇动，促其尽快干燥能够迅速干燥的血液涂片，细胞不变形、不皱缩便于分辨结构；长时间不能干燥的血涂片，细胞会发生皱缩染色后呈一团致密物，看不清结构影响對细胞的辨认。

3.染色：选定制备好的血液涂片在血膜近两端两侧以内适当部位，以特种笔（玻璃器材用笔）各划一橙线作为防止染液擴散的堤。然后滴加wright染色液于血膜上（以布满两划线内的血膜为度）静止约1min，以便染色液中的甲酵固定血细胞此后按预试验时确定的染色液、缓冲液比例（一般情况为1：1．5—2）滴加缓冲液，充分混匀静止2—10min，随时以显微镜的低倍镜观察细胞的着色情况待呈现细胞核、浆分明，染色良好时即可以自来水的细小水流冲去染液（切莫倾去染色液后再冲洗，这样会残留染色渣滓）干燥后镜检。

4.白细胞分類计数：先以低倍镜检视全片选择细胞分布均匀、着色良好区域（通常在中末l／3交界处）滴加香柏油，转油浸镜入光路沿弓字形轨道姠尾部检视（图1—9），对各种白细胞分别立户以画“正”字形式分别计数各种白细胞，直至总数为100为止最后计算各类白细胞的出现率（%）。

1.血膜厚薄要适宜规律是：血滴越大、涂抹片与载物玻片间的夹角越大、红细胞增多症等，涂制的血膜要厚些反之则薄些。要反複练习才能制得合格的血液涂片。

2.染色过程至染妥后细小流水冲洗前．切记莫让染液干涸染色结束时要以细小水流冲洗染色液，切不鈳先倒去染液而后冲洗否则会残留沉渣。

3.染色液的滴加量、染色液与磷酸盐缓冲液的比例搭配、染色时间的长短等要依具体情况而定偠做到每批新配制的染液、缓冲液，要首先找出最佳染色关系而后投入使用。

白血病人的血细胞常常有着色困难，遇此应适当延长染色时间。着色好坏可将“湿片”置低倍镜下观察当见到核染色质清楚、核浆界限分明时，即应立即流水冲去染色液

4.在白细胞分类计數的同时．还应留心各种血细胞有无形态及核、浆结构的异常状态，注意有无血液寄生虫如观察到细胞形态异常或找到寄生虫应详细分析，并报告观察到的情况

以各种类型白细胞所占百分比报告。

成人：中性杆状核粒细胞 1%——5%

【要求】 通过显微镜观察认识血小板形态叻解血小板目视计数方法及操作程序．记住血小板计数参考值。

【原理】 血小板稀释液的化学成分有溶解无核红细胞、固定血小板与防止其聚集和变形、而便于计数血小板的作用将定量稀释的血小板悬液充入血细胞计数室，显微镜下计数血小板换算成每升血液中血小板數。

3.余同红细胞计数用器材

（1）铁氰化钾血小板稀释液

  将枸橼酸钠和氯化汞以600.0ml蒸馏水加热熔解。用量一容器将铁氰化钾以200ml蒸馏水溶解后傾入上液中混匀并继续加热。把握加热过程中稀释液的颜色变化及时终止加热时配置稀释液成败的关键。规律是：初混时为黄色随著加热逐渐变为深黄绿色，待色调变浅呈黄绿色时应及时终止加热。待冷却后以蒸馏水补足液体总量至1.0L。为更好显示血小板可另加叺1.0g/L荧光素酒精溶液0.5ml。混匀过滤备用。

此液室温存放一年以上不变质缺点是与血液作1：20稀释时，有的白细胞破坏不全计数时应留心鉴別。

（2）草酸铵血小板稀释液成分：

此液破坏无核红细胞完全血小板形态清楚。

1.以1．0ml刻度吸管将0．38m1血小板稀释液加于小试管内

2.利用毛細血管采血法采集血液20ul．加于上列血小板稀释液底部、然后以上清液清洗毛细管内残留血液三次，轻轻混匀

3.待红细胞溶解混悬液变为透奣后，再轻轻振摇lmin吸取血小板悬液15ul左右充入血细胞计数室。

4.静置15mm（空气干燥季节应将血细胞计数板置湿盒内）以显微镜的低倍物镜找箌计数板上中央大方格后，改用高倍（40 x）物镜在红细胞计数大方格内计数4个角和中央共5个中方格的血小板。

【注意事项】  血小板较其它血细胞脆性大、易碎裂操作稍有不慎即可导致计数结果偏低；血小板体积小，易与碎屑、尘埃混淆而使计数结果偏高所以，血小板计數工作除遵循红、白细胞计数的注意事项外还应注意以下几点：

1.试验所用器、物应洁净．不可有细菌、尘埃污染。混入血小板悬液的细菌、尘埃可诱发血小板聚集并进而自身碎裂。对每一个血小板和污物要仔细鉴别。血小板大小较一

致、圆形或椭圆形细胞内质地一致，显微镜调好焦点后再以显微镜的细调节上下轻轻调动焦点时，血小板会闪现均匀一致的绿黄色光点而杂质、尘埃则是大小悬殊、形态无规律，调动焦点时山现或—团黑、或甚亮的一点

2.采血时刺针一定要达到足够深度（3mm），以血液自动流出为准切勿挤压采血。血尛板脆性大挤压使血小板破裂，释放出凝血活性物质导致凝血亢进；另外挤压会致组织液混入血液，影响实际采血量造成计数偏低。针刺后如无血液流出应改换部位重新穿刺。

3.血液离体后血小板更易发生聚集所以毛细血管采血、将血液加入血小板稀释液以上清液洗涤毛细管内血痕、均匀混合等操作步骤，应迅速而适度操作不敏捷、混合力度不足会使血小板发生聚集；强力混合会导致血小板破坏。

4.血小板小而轻在液体中下沉很慢。血小板悬液无人计数室一定要静置15min待血小板沉降至计数室的玻璃平面后才可计数。若血小板不在哃一焦平面而依靠细调节调

焦寻找不同层次的血小板．会漏计，使结果偏低

5.计数血小板用光线强度甚重要，光线强时会穿透血小板造荿漏计结果偏低。

6.相差显微镜、暗视野显微镜计数血小板结果最淮确

2．血液学分析仪计数法

参见血液学分析仪简介。

【要求】  熟悉网織红细胞各型形态网织红细胞染色原理、计数方法、了解计数注意事项，记住网织红细胞计数参考值

正常情况下，自骨髓进入外周血嘚红细胞脑浆内尚有核糖体（ribosom）、核糖核酸等嗜碱什物质残留。在其进入外周血的24—48h内能够合成一定数量的Hgb（约为每个红细胞Hgb总量的l／5），以替代上列嗜碱性物质细胞内嗜碱性物质消失即成为完全成熟的红织胞。细胞存活状态下其细胞膜允许某些碱性染料进入细胞內，例如：煌焦油蓝、新亚甲蓝、台盼蓝等、细胞浆中的嗜碱性物质与上列碱性物质结合染成深浅不一的短色颗粒状或网状物，这种红細胞称网织红细胞细胞内无核糖体、核糖核酸的红细胞不会出现蓝色．是完全成料进入细胞内，所以死亡后的细胞即不能着色故又称細胞活体染色法。实际工作中常常以其判定细胞存活状态

  细胞经活体染色后在显微镜下计数l000一2000个红细胞，记录其中有颗粒状或网状物者求出网织红细胞所占百分比。与网织红细胞计数的同时行血液红细胞计数、以此换算出网织红细胞的绝对值熟红细胞的标志。己死亡嘚细胞其细胞膜即不允许上列染

1.一般材器同白细胞计数和白细胞分类计数器材（见12页和15页）

2.缩小视野用开窗圆形硬纸片  以硬纸做一直径約20mm（较目镜内径稍小）的圆形，正中央开一边长为3mm的棱形或正方形小孔备置接目镜光阑处。3.37℃恒温水箱

    以蒸馏水将上列成分溶解并加臸100．0 m1，摇匀、过滤储于棕色瓶中备用。用前应取少量染液置载物技片显微镜下观察，如发现染料渣滓应再行过滤后使用。

    以蒸馏水溶解上列成分并加至l00.0m1过滤后储存于棕色瓶中备用．使用前取少量染色液置载物破片．显微镜下观察，如发现染料渣滓应再行过滤后使用

1.取染色液2滴加入试管中．取血液（手指或静脉）2滴加于上列染色液管中，混匀以胶塞（或棉塞）塞紧试管口，以防水分蒸发、影响计數结果

2.室温下（如室温低于25℃时，则应将其置37℃恒温水箱）15—20min使网织红细胞的网状物被染色。

3.取血液与染色液的混合物一小滴置洁淨载物玻片—端，以血液涂片用涂抹片推成较薄的血膜

4.以低倍镜浏览全片，择细胞分布均匀无重叠染色良好部位（常在涂片中末1／3交堺处），滴加香柏油转换油镜（100 x）至光路中；将缩小视野用圆形硬纸片放入镜筒内光阑处，调整焦距计数1000一2000个红细胞，并记录其中遇箌的网织红细胞

相对值：记得网织红细胞数/所计红细胞总数xl00

绝对值：血液红细胞数/L斜线上部分x计数相值（x%）斜线下仍为L。

1.尽管网织红细胞计数是一个古老的实验项目但其定义、所包括的范围各家意见至今尚不一致。Heilmyer将其分力5个类型含有核红细胞，称为“（）”型（亦稱花冠型）；血液学标准委员会和美国的国家临床实验室标准委国际员会的规定是：以新亚甲蓝染色液染色后在无核红细胞胞浆内，出現两个以上蓝色颗粒者称为网织红细胞将网织红细胞定为4个类型。两种分型方法不同（所包括的细胞分化阶段都不一致）自然其定义亦不会一致。好在正常情况下血液中无有核红细胞即或出现有核红细胞，依其形态学特点在显做镑下亦易作出鉴别，对结果影响不大

2.网织红细胞染色属活体染色法，血液离体后应迅速与染色液混合、染色若操作有误，细胞已经死亡后即或胞浆内有大量核糖体及核糖核酸，细胞亦不会被染成网织红细胞基于上述，所以本法又可做为细胞存活与否的证据

3.网织红细胞计数影响因素很多，室温低25℃时应将其移全37℃恒温水箱内染色；染色时间一定要大于15min；染色完成后涂制的血膜应尽可能薄些，要选取两张以上血膜多点计数间织红细胞以使其有代表性；染色后的涂片应尽早计数，久置则网状物被溶解而消失．特别是湿度大的夏季更应尽早完成计数；若以wright或Giemsa染液复染血膜网织红细胞数会明显降低，应知晓！

附  网织红细胞生成指数

贫血时在诸多因素调控下，使不同病因、不同贫血程度的骨髓释放数量鈈等、幼稚程度不同的网织红细胞入血达细胞浆内的核糖体、核糖核酸完全消失所需时间，要比正常人血液中的网织红细胞长的多此時的网织红细胞计数相对值、绝对值皆不能准确反应骨髓生成红细胞的功能状态。Finch提出网织红细胞生成指数（RPI）这一测试指标用以推算貧血病人的网织红细胞生成相当于正常人的多少倍，并且可以作为病因诊断的辅助指标

【器材】  同网织红细胞计数（参见23页）、红细胞仳积测定（参见本页“红细胞比积测定”）。

“2”为网织红细胞成熟时间（天）

【要求】了解红细胞比积测定的原理、方法记住参考值。

【原理】  红细胞出积又称红细胞压积（Packed cell volume）是以特定的不改变红细胞大小的抗凝剂制备抗凝血液，将其装入wintrobe管或特制的毛细管以一定嘚相对离心力（relative centrifugal force，RCF）、时间离心沉淀使红细胞压实，以测定出红细胞与全血的比积关系

常用的方法有三种：wintrobe法、毛细管法和血液学分析仪法

1.wintrobe管及配套小橡胶塞：为特制厚壁玻璃管。管长120mm左右管内径2．5—3mm．管壁的厚薄、管腔内径的大小要求均匀—致、管的内壁底面平坦，外壁底部钝圆与管内壁底部平坦面相水平的外壁无刻线。此处对外管上刻线的右侧说是刻线的起始部，即为“0”自此向上垂直的刻有间隔为1mm的105条横线，由下而上每逢5（515，25…，105）标为次长线每逢10（10，2030，…l00）标为长线。在到线的右侧自下而上每逢长线依次标絀1一10作为读取红细胞比积之用；在刻线的左侧自上而下，每逢长线依次标上0一9与右侧对应的无刻线与数字的部位意即为“10”，该侧数芓作为读取红细胞沉降率之用Wintrobe管容量约0．5一0．7m1左右。

2.细长毛细滴管或2．0ml注射器（附有腰穿针头）

    细长毛细滴管：由毛细部分、壶腹部分囷橡胶帽组成毛细部分外径小2mm，长大于120mm壶腹部分制妥与橡胶帽吻合的接口，总容量约2.0ml

3.13mmxl00mm试管或清洁干燥的青或链霉素小瓶。

4.1．0ml刻度吸管和橡胶吸球

40．3mmol／L乙二胺四乙酸二钠盐或乙二胺四乙酸二钾盐。取EDTA—Na15．0g或EDTA—K16．3g以蒸馏水溶解，并加蒸馏水至1．0L

3.抗凝管（或瓶）的制備：以1．0ml刻度吸管吸取上列EDTA—Na或EDTA—K溶液．加于试管或青霉素小瓶内，每管（或瓶）0．2ml轻轻摇动，使管或瓶壁附着抗凝剂80．0℃以下烘干備用；若所用抗凝剂为肝素纳盐溶液，每管、瓶加入抗凝剂量及摇动方法同上但应在50．0℃以下烘干、温度高可使肝素灭活。如上制备的忼凝管（或瓶）每个可抗凝血液2．0m1。

1.取静脉血液2．0ml立即加入抗凝管（或瓶）溶解抗凝剂并充分混和，以达抗凝效果操作手法要轻，鈈可产生气泡

2.以细长毛细滴管或附有腰穿针头的2．0ml注射器，吸取混匀的抗凝血将细长毛细滴管或腰穿针的尖部插至wintrobe管底部，将血液缓緩加入管内边加血边往上提滴管或注射器，直至血液的液平面与刻线标号10平行为止加血过程切忌有气泡产生。装妥血液后及时加盖小橡皮胶塞以免液体蒸发而影响结果。

3.置水平式离心机中以相对离心力（RCF）2264g离心30．0min。取出Wintrobe管可见不同色调的五个层次，自上至下依次為：淡黄色——血浆层、乳白色——血小板层、灰红色——有核细胞层（含白细胞及有核红细胞）、紫黑色——含二氧化碳血红蛋白的红細胞层和鲜红色——含氧合血红蛋白的红细胞层择紫黑色层以记号笔做—标示线．以上列相同的相对离心力，再离心10min如果作标示线处嘚紫黑色层，未再往下移即表示红细胞已压实，标示线下刻线代表的毫米数乘以0.0l的积为每升血液中红细胞所占体积的升数；离心后若紫黑色层下移．则再以记号笔按下移位置重新标线，如此重复直至离心后紫黑色层不再下移为止。计算方式同上若离心用RCF不小于2264g，时間不小于30．0min红细胞都能被压实.

1.抗凝剂的选择和使用是影响红细胞比积测定准确性的重要因素之一，已知单独使用草酸钾抗凝可使红细胞體积缩小11%单独使用草酸铵抗凝可使红细胞体积胀大，因此制备双草酸盐抗凝剂但其抗凝结果仍使红细胞微微缩小．故现已废弃不用。EDTA—K（或EDTA—Na）作抗凝剂．对红细胞大小的影响甚微，并且抗凝血置室温放置两天内红细胞的大小不变但应严格控制其使用浓度，＞2mg／m1时則可使红细胞缩小肝素钠作抗凝剂对红细胞大小约影响最小，可略去不计

2.采血用具、盛血用具及测定器具必须无水珠，以防溶血

3.空腹采血为宜。最好不使用压脉带否则束臂时间应小1min，不然会造成血液淤积浓缩使测定结果偏高。

4.采得血液后应尽早与抗凝剂充分混合以防出现细小凝血块；摇动不可过猛，以防溶血；装wintrobe管前一定将血液充分混匀装入过程中不可产生气泡，装入量要准确

5.RCF直接影响Hct，ICSH建议使用RCF 2000—2300g因此，用作试验的离心机应测定出实有数据

6.遇血浆颜色过余黄染、乳白，灰白层加厚等情况应在报告单上注明，它显示偅要的临床意义

    该法可以已肝素化的毛细玻管、借毛吸现象、自无名指至耳垂采集血液．可免去从静脉采血。所用离心机应为高速离心機（27000r／min）．亦可改用普通离心机（3500一4000r/ min）完成试验

2.毛细玻管：长75mm，外径1．6mm内径0．8mm。

3.肝素化毛细玻管：上列规格的毛细玻管以重铬酸钾——硫酸清洗液浸泡过夜自来水、蒸馏水冲洗洁净、烘干；借毛吸现象将wintrobe法中使用的15万IU/L肝素溶液吸引进毛细玻管中，然后甩去多余的肝素溶液使仅留毛细玻管内壁附着的一层肝素溶液（每支管约有2IU肝素）。再垂直置于50℃烤箱烘干备用

5.酒精喷灯或煤气灯。

6.毛细血管采血用器材

1.在无名指或耳垂实施毛细血管采血。弃首滴血后以肝素化毛细玻管的—端接触流出的血滴（切勿触及伤口，以防感染）另一端微下倾，因毛吸现象血液会自动流入管内待血柱达管长的2／3—3／4时即停止采血。

2.将已采集血液的毛细玻管置左右两掌心间轻轻撵转、鉯达最佳抗凝。

3.以橡皮泥封闭毛细玻管无血迹端（橡皮泥应进入管腔内2—3mm）或以灯融封管口。

4.以小块胶布标写标本号并粘贴于毛细玻管嘚一端

5.已采血、封口、标妥的毛细玻管，封口端朝下置离心管内直角离心机使用4000r／min离心20．0min，斜面离心机使用3500r/min离心30.0min。

6.取出毛细玻管精确测量血住长度与红细胞部分的长度，计算出红细胞比积

1） 一般注意事项同Wintrobe法的（1）一（7）。

2） 毛细血管采血的穿刺深度应以血液自動流出为度不可强行挤压，以免混入组织液而影响结果的正确性

3） 按照wintrobe法采集的抗凝血，亦可以毛吸现象吸入洁净、干燥、无肝素的毛细玻管中此后的操作同毛细管法。

4） 封管—定做到坚固、严密以灯封管应不断转动毛细破管，使其受热均匀、以免血液溶解、凝固戓细胞体积发生改变

5） 若同时测定多份标本．可以橡胶圈将毛细玻管扎束成捆，一次离心测定

6） 严格控制RCF值和离心时间，遇到Hct＞0．5L/L的標本必须重复离心，按最终数值报告

3.血液学分析仪法  （参见36页）

1.进一步熟悉静脉采血技术，每组采集静脉血液一份依操作规定实施wentergren法红细胞沉降率测定o

2.掌握EsR测定原理、方法、注意事项，记住参考值

红细胞比重大于血浆．受地心引力作用红细胞下沉。其沉降速度遵循“固体在液体中下沉时其沉降速度同该团体表面积与体积之比成反比”规律。正常情况下．红细胞表面被覆唾液浚带负电荷，红细胞彼此排斥．使之保持25nm距离当血液中带正电荷的物质，例如纤维蛋白原、Y—球蛋白等增多时红细胞表面的负电荷被中和．红细胞的‘‘盤状平面’’彼此贴合而形成红细胞钱串（rouleau）。两个红细胞贴含即消除两个“盘状平面”在此基础上每增加一个贴合的红细胞，即多消除两个“盘状平面”但红细胞的体积并未发生改变，形成总的表面积缩小而总体积仍旧所以ESR呈现规律性加快。借此道理将抗凝血液加叺westergren管实施ESR测定测定ESR的方法很多、westergren法是国际公认的标准方法，做一介绍

0.5mm．内径2.55mm±0．15mm．内径均匀，误差小于0．05mm自下而上在200mm±0．35mm内划刻线。自最上边的一条刻线开始往下间隔1mm（最大误差小于0．2mm）做196条刻线，最下边的4mm内不做标线自上边的第一条刻线（含此线）起每逢10（10，2030，…190）为长刻线，每逢5（515，25…，195）为中长刻线余为短刻线。在最上边一条线上面标“0”、往下每间隔一条长线标出24，6…，18代表厘米数，再往下不做标记

5.静脉采血用具及消毒剂。

桐椽酸钠3．2g溶于蒸馏水并加至100．0mL以0．22um滤膜过滤于无菌溶器，4℃保存使用前置室温复温后使用。如显混浊不可再用。

1.以刻度叹管取109mmol/L枸橼酸钠溶液0．4m1加入试管内。

2.静脉取血2．0ml迅速加于上列试管至刻线，立即混匼均匀

3.以橡胶球将抗凝血吸入血沉管并调节至刻线“0”处，拭去血沉管尖外侧血液直立于调整为垂直位的westergren血沉管架。

4.18—25℃环境静置1h調整视线与血浆、红细胞分界线为水平位置，仔细观察分界线对应的血沉管划线的毫米数

westergren血沉管必须标准，内径大血沉加快内径小血沉减慢。

采血用具、westergren血沉管必须干燥洁净以防溶血；若管内贴附有脂类、蛋白质等物质，会使血沉减慢

westergren血沉管架应置无直射光平稳防震德的平台上，首先调整其垂直性要求误差在1度内。放置装妥血液的血沉管时特别注意垂直性，经验证明倾斜3度血沉会加快30%。

实验應置18—25摄氏度环境进行温度过高降低血液粘度，血沉加快温度过低血沉减慢。

本世纪30年代工业实验室创用电子计数仪检测样品中的懸浮微粒，故亦称微粒计数仪1953年coulter设计了以电阻改变为基本理论的血细胞计数仪，因具科学性、先进性、实用性而在医学实验领域得到快速发展

    血液学分析仪可分为光电型、光散射型、电容型、电阻型等。

    光电型工作原理：血液被稀释液稀释并成为细胞悬液当其流过光束时，血细胞吸收光线比稀释液吸收的光线多所以透过的光线出现了多少的不同，透过光线照射到光敏原件（光电池或光电管等）后產生的电能亦不同，出现脉冲信号．而达到计数的目的

    光散射型工作原理：一定体积的光束垂直穿过流动着的稀释后的血细胞悬液，经暗视野光盘再到光敏原件；光束通过稀释液不发生散射光线完全被暗视野盘挡住，光敏原件无光线照射无信号产生；光束射到流过的細胞上，则产生光散射即光线改变原行进方向，绕过暗视野盘到达光敏原件光能变为电能．产生信号而做出计数。

    电容型上作原理：茬两极间加高频细胞悬液在阴阳两极间流过时，细胞及稀释液诱发静电容量是不同的以此获取信号做出计数。

    上列三种类型皆有易受外界环境干扰、灵敏度低等不足而被淘汰。

    电阻型工作原理：前已述及实施血液中细胞计数须以相应稀秆液将血液稀释后，才能进行这些稀释液都是电的良导体；与稀释液比较，各种血细胞都是电的不良导体利用转换器（亦称传感器，小孔管等）及配套装置可甚為简捷地测定出血细胞悬液中的各种细胞的数目、体积，并可导出多种相关参数

在半个多世纪的发展中，它融入了荧光技术、激光技术、高频传导技术、立体测量、酶学反应、免疫细胞化学等高新科技成果而使其功能多样化。高档者含网织红细胞计数、细胞DAN测定发现Φ性粒细胞核左移，嗜酸性粒细胞增多、淋巴细胞异常形态、幼红细胞、原始细胞（但不能确切分辨）淋巴细胞免疫型等，以及数据存儲、质量控制、提示警报等诸多功能大有包揽流式细胞仪（flow cytometry，FCM）的功能而合二而为一的趋势故现在已称其为血液学分析仪了。尽管如此但其在分辨细胞异常形态的功能上尚不满意，需要改进以替代目视显微镜是发展的重点。

【各参数的中英文名称】

  当前县级以上及—些区级医院已购置不同类型的血液学分析仪但有的临床医师对某些参数及直方图尚缺乏必要的了解，因此结合医学专业的需要，将囿关原理、参考值及简

要的临床意义列后为了叙述方便按实验原理分组介绍。

含白细胞、红细胞及血小板计数完成计数的重要部件起始于转换器，它是一个特制玻璃管在其侧壁下部开口镶嵌宝石，宝石上开出与待测细胞大小匹配的小孔；转换器内外各设一个电极并通—恒定直流电；转换器上部连接负压系统，以其吸引细胞悬液在单位时间内定量通过小孔；细胞通过小孔的瞬间取代同体积的稀释液細胞、稀释液二者导电能力不同．因而产生与细胞数量反体积成正比的脉冲。可用欧姆定律表示：E=IR 式中E电压，I为电流R为电阻o I是恒定值，故R增大则E增大试验中细胞通过小孔的瞬间R

值增大，故E必然增大而产生脉冲；这种信号甚微弱最强者亦在几十微伏之内，不能计数．需经前置放大器放大血细胞、其它颗粒性物质和电噪音等皆可产生脉冲信号，鉴别器可消除细胞信号以外的大部分无用信号细胞信号進入阈值调节器，该器凭借精密的电位器给出标准电平；根据待测细胞大小调节阂值度阂值以外的信号被消除。温度对物质的导电能力影响甚大温度增高则导电能力提高而电阻变小，脉冲信号变弱为此在外电极上装配了热敏电阻鉴测器．在电路中以其完成温度变化的補偿，给出校正后的脉冲波；这种波是尖峰的不能直接计数，通过整形器将其变为方形波才能被数码管接受最终给出计数值。

    总之使用血液学分析仪除了快捷等优点外，可给临床医师提供多种精密的诊断参考数据；给实验操作者提供直观的仪器工作状态和给出参数的鈳靠性应善于运用。

【目的要求】  通过显微镜示教以及观察骨髓涂片．使学生能了解骨髓涂片细胞分类的方法初步辨认正常骨髓细胞形态，并对常见的几种血液病（如白血病、贫血等）的骨髓象有初步印象

【器材】光学显微镜、二甲苯、香柏油、拭镜纸、骨髓细胞分類记录纸、骨髓检查报告单。

【试剂】wright染液及其缓冲液

选择厚薄适宜，含有骨髓小粒的骨髓涂片及血涂片各一张按Wright染

色法进行染色，矗到在低倍镜下看到有核细胞着色良好后用流水冲去染液待自然干燥。

1.取材、涂片、染色是否满意如不满意须更换标本要对重做骨髓穿刺。

2.观察有核细胞与成熟红细胞的比例以判断骨髓增生程度。

3.计数全片（特别要注意涂片的边缘和头后部分）巨核细胞数目并用油鏡确定其发育阶段。

4.注意涂片末端有无体积较大的特殊细胞如转移瘤细胞、niemann—Pick细胞、Gaucher细胞等。

   选择细胞分布均匀的部位用油镜进行分类計数一般从中末2／3交界处向尾部迂回，至少计数200个有核细胞随观察随记录企骨髓细胞学分类记录纸上。在分类计数的同时还应做下列檢查

1．  观察粒细胞系各类细胞在涂片中所占比例及粒细胞系统各阶段比例，注意形态有无异常核浆比例及发育是否平衡，胞浆小有无Φ毒颗粒及空泡变性有无Auer小体等。

2．  观察幼红细胞占骨髓有核细胞的比例各阶段幼红细胞的比例及有无形态异常。

3．  观察淋巴细胞、單核细胞比例注意形态有无异常。

4．  观察其它细胞如网状细胞、浆细胞、组织嗜硷细胞、内皮细胞等形态及其比例

5．  观察涂片中巨核細胞数量、幼稚型与成熟型的比例，形态变化及有无血小板生成同时注意血小板的多少、聚集状态及形态改变。

6．  有无寄生虫如疟原蟲、L-D小体等。

7．  注意有无肿瘤细胞

（4）骨髓象分析及诊断

分类计数后，计算出各系统、各阶段细胞所占计数百分比计算粒、红比值。將检查结果逐项填入骨髓检查报告单并描述其主要特征。并将与骨髓同天取材的血涂片进行细胞分类计数l00个细胞，求其分类百分比描述成熟红细胞形态，血小板形态处分布情况将骨髓象、血象和临床资料作综合分析提出细胞形态学诊断意见或参考意见。

   在写出报告の后．将骨髓涂片用二甲苯及拭镜纸做脱油处理然后贴好标签（包括病人姓名、性别、年龄、检验号、诊断、年、月、日等）连同骨髓塗片、血液涂片、送检单—并存档。

1.涂片用骨髓要适量并应选择骨期小粒制片。一张好的涂风应分辨出头、体、尾三部分骨髓中纤维疍白原含量高、易凝固，故取材、涂片的操作必须迅速所用载玻片必须无油垢（玻片经清洁液浸泡过夜、水冲洗，0．95L/L酒精浸泡24h纱布擦幹备用）。

2.涂片涂制后应立即晃动使其尽快干燥以免细胞皱缩变形。因骨腿涂片中有核细胞远较血涂片中为多．含脂肪也较多故染色時染色液需适当多些，染色时间也需适当延长

3.应全面了解每个细胞的形态特点，仔细辨认切不可随意选入或摒弃。

4.有些细胞处于过渡階段具有上、下两个阶段的某些形态特点，应按下划不上划原则将其划分到较晚阶段；当核浆发育失衡时多以细胞核的形态、结构及染色特点等作为划分发育阶段的主要依据。

5.各种原始细胞彼此无显著差异，因而不易鉴别必须对整个涂片作仔细观察、并参考其周围汾化较好的幼稚细胞加以判断。必要时作有关的细胞化学和免疫细胞化学染色协助鉴别

6.在分类计数过程中，如遇形态特殊、难以归类的細胞时可暂定位“分类不明细胞“。如此类细胞数量较多应进—步做化学染色（或免疫细胞化学染色）和超微结构分析等以明确诊断。

7.检查骨髓涂片的同时应做血涂片进行仔细观察．以利于细胞形态的辨认和全面分析

细胞化学染色以形态为基础，结合运用各种化学及苼物化学技术对血细胞的各种化学成份、代谢产物做定性、定位和定量的观察，协助了解血细胞的化学组成．代谢活动生理、病理变囮，从而为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察和预后判断提供依据

【原理】  粒细胞以及一部分分化较好的单核细胞的胞浆内的过氧化物酶，能将过氧化氢的氧释放出来使联苯胺氧化成联苯胺蓝、后者与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒沉淀于胞浆中。

88L／L乙醇Φ置棕色瓶内，放冰箱个保存

2)       亚硝基铁氰化钠溶液：在少量蒸馏水中，加入亚硝基铁氰化钠晶体至不溶解为止，置棕色瓶内放冰箱中保存。

294．1mmol/L过氧化氢溶液：取30％过氧化氢1m1加入蒸馏水29m1放入冰箱中。

稀过氧化氢溶液：取294．1mmo1／L过氧化氢1滴、加入10ml蒸馏水稀释（需临时配淛）

TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰化钠饱相溶液10ul溶液呈淡棕黄色。此试剂在临时配制

在新鲜干燥的骨髓或血液涂片上，加4．44mmo1/LTMB-亚硝基铁氰囮钠饱和溶液的混合试剂0．5m1固定1min后，再加入上列稀过氧化氢溶液0．7m1混合染色6min。

附注：1.TMB配制在0．85—0．88L／L的乙醇溶液个央染色效果好乙醇浓度过高细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂渗入染色效果不佳。2.过氧化氢浓度与加入量切勿随意改变3.染色液pH应为5．5，微偏酸环境蓝色较为稳定。

【原理】  甘油磷酸钠在NAP与镁的存在下与氯化钙作用，形成磷酸钙后者与硝酸钴作用，形成磷酸钴磷酸钴与硫化胺莋用，形成黑色的硫化钻并定位于成熟的中性粒细胞的脑浆中

【观察方法与结果】  观察100个成熟中性粒细胞并计算积分。胞浆中呈现灰色臸棕黑色沉淀为阳性积分标准及计算如下：

    （+++）为3分：弥漫着色或有丰富的着色深的颗粒，但少见致密团块

阳性率范围为2％一76％，平均37.3％以弱阳性为主。积分范围一般在80分以下女性稍高于男生，在月经周期中之分泌期与增生期较高在妊娠期中NAP活冲也增高。

1)       含有甘油磷酸钠的培养液必须新鲜配制，置冰箱中待用甘油磷酸钠及巴比妥等应以换算的配制量临时称取。

培养液PH为9．4可用1mmol/L氢氧化钠或1mmo1／1鹽酸纠正。pH值增高可使细胞肿胀和酶扩散；pH降低，沉淀物分解

在化脓性感染、类白血病反应、骨留纤维化时、NAP增高。慢性粒细胞白血疒中降低有助于鉴别诊断；也有助于肝脓疡与肝癌、早期大叶性肺炎与病毒性肺炎的鉴别。在急性白血病时粒细胞型者NAP活性降低，淋巴细胞则增加单核细胞型有的增加．有的降低。有人认为难治性贫血而骨髓粗细胞系增生的患者．若NAP降低或消失提示有MDs的可能再生障礙性贫血，NAP往往增高在垂体—肾上腺皮质机能亢进及应用肾亡腺皮质激素时，NAP活性均增高

【原理】  含铁血红素的铁离子在盐酸环境中與亚铁氰化钾作用，生成亚铁氰化铁即普鲁士蓝反应。

（2）酸性低铁氰化钾溶液：200g/L低铁氰化钾（即黄血盐棕色瓶内暗处保存）。浓盐酸（比重1.19）  取1中5.0置试管中缓缓滴加2，边滴边摇至出现白色沉淀（约1.0m1），再改滴①至白色沉淀消失此液临用前配制，用后废弃

（3）1．0g／L，中性红溶液

1.选骨髓小粒丰富的涂片用甲醇固定5min。

3.酸性低铁氰化钾溶液作用30-60min

6.流水冲洗．晾干，镜检

【结果判断】  幼红细胞核染荿鲜红色，胞浆呈淡黄色铁粒呈鲜艳的蓝绿色。

（1）细胞外铁的检查和分级标准

    在低倍镜下从涂片尾部寻找骨髓小粒然后用油镜判定鐵量。

  （+++）有很多铁小珠或少许铁小块。

   （++++）密布铁颗粒其间有铁小珠，铁小块或铁小珠铁小块成堆

低倍镜下选择涂片体部较薄、细胞分钟均匀的部位改用油镜，计数100个中幼红和晚幼红细胞记录阳性细胞（胞浆内有蓝色颗粒）的百分率。同时注意细胞内铁颗粒数目、大小、染色深浅、注意有无环形铁粒幼细胞也有的按细胞阳性程度分为四型：

Ⅰ型：胞浆内有1-2个铁粒。

Ⅱ型：胞浆内有3-5个铁粒

Ⅲ型：胞浆内有6-10个铁粒。绕核呈环形排列时称环形铁粒幼细胞。

Ⅳ型：含铁颗粒11个以上

细胞外铁：“+”~“++”。

细胞内铁：铁粒幼细胞60%（30%~90%）多以中幼红细胞为主，正常人以Ⅰ型为主可有少数Ⅱ型，无Ⅲ型及Ⅳ型无环形铁粒幼细胞。

免疫细胞化学染色法是利用McAb检测细胞表面（mCD）或细胞浆内cyCD有无相应抗原，以此判定细胞的属性和分化阶段对深入了解白血病细胞的发生、发展过程，对指导治疗和预测预后提供了较可靠的依据

M0：是唯一只有通过免疫表型分析才能确诊的一个亚型。其诊断要点：SBB／MPO阴性或阳性率＜30％淋系标志（如CD₃、CD₇₉、CD₂₂等）陰性．而CD和TdT 可呈阳性，超微水平MPO或髓系特异性McAbs（MPO、CD₁₃、CD₃₃）中至少一个呈阳性大部分患者表达未成熟细胞标志CD和HLA—DR，P170亦常呈阳性

M₆：包括两組患者，其—是以晚期／成熟红系细胞为主特点是抗血型糖蛋白A阳性；其二是早期／未成熟红系细胞为主．白血病细胞为原始红细胞或未分化细胞，细胞化学染色MPO^-免疫表型特征为HLA—DR^-、CD₃₆⁺、淋系标志^-，髓系标志^-CD₃₃^±，但血型糖蛋白A⁺和B⁺Spectrin^±或经体外培养后可出现ABH血型抗原。

M₇：免疫表型特点是：CD₃₄、CD₃₃或CD₁₃常阳性但常特异的标志是因子Ⅷ相关抗体和血小板糖蛋白GPⅢａ（CD₆₁）和GPⅡb/Ⅲa复合物（CD₄₁）。免疫表型是目前确诊M₇的主偠手段

2．急性淋巴细胞白血病

利用免疫学方法可将急性淋巴细胞白血病分为非—T细胞型和T—细胞型两大类。

非T—细胞急性淋巴细胞白血疒分为五个亚型：普通型（common—ALL）、前、前B型（PrepreB—ALL）和B细胞型（B—ALL）前B细胞型（pre B—ALL）和B细胞型（B—ALL）。以McAb鉴别各亚型情况如下表

②     T细胞型分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，分别相当于胸腺发育阶段的早期胸腺细胞、中期胸腺细胞和晚期胸腺细胞

—ALL50%以上有縱隔肿块，45％以上病例白细胞大于100×10⁹／L常发生皮肤浸润，贫血成人T—ALL常无胸腺浸润、但常有明显的淋巴结、肝、脾肿大。

急淋免疫亚型发病率：以免疫学方法分类的急淋亚型间的发病率在亚洲与欧美有所不同．欧美各国以CALL最多在儿童病例中可达70％以上，亚洲国家的报告CALL占半数左右成人儿童间差别不大、B祖细胞型和前、前B型占28％、T—ALL占21％，B—ALL占1．5％前B型占0．5％。在T—ALL中I期占56％、Ⅱ期占24％、Ⅲ期占20％。

急淋免疫亚型和预后的关系：以往认为CALL预后最好T—ALL的预后在儿童和成人间无差别。80年代后期对成年人ALL采用强烈化疗收到良好效果、有报道完全缓解率达94％；将儿童和成年人急淋分别统计，按预后最好至渐次的顺序是：在儿童中以CALL最好；前、前型和B祖细胞型次之；T—ALL洅次；前B细胞型和B细胞型最差在成年人中T—ALL最好；CALL次之；前、前B型和B细胞型再次；前B细胞型和B细胞型最差。

3．慢性淋巴细胞白血病

原红細胞：厚感胞浆呈蜡笔画暗蓝。核染色质呈粗颗粒状、有核仁；如核仁消失核染色质浓集则为早幼红细胞；核、浆比例各1／2，核染色質呈压碎墨感或车轮状为中幼红细胞；如胞浆完全血红蛋白化呈粉红色核仍有压碎墨痕迹；或胞浆呈粉炭色、蓝红色多色性，但核已固縮；或核固缩成炭核浆呈谈粉红色称晚幼红细胞；胞浆中含有核糖核酸等嗜碱性物质，无论有无细胞核皆称网织红细胞；圆形、无细胞核、细胞中心部位的1／3着色浅淡，即为成熟的红细胞

原粒细胞无或仅有极少量细小的嗜天青颗粒；细胞浆中有较多的嗜天青颗粒者为早幼粒细胞。早幼粒细胞无特异性颗粒有特异性颗粒的细胞为中幼粒细胞。中幼粒细胞的细胞核无明显凹陷细胞核明显凹陷的粒细胞為晚幼红细胞。晚幼粒细胞胞核凹陷不得超过假想核直径的l／2核凹陷大于假设直径1／2的粒细胞为杆状核粒细胞。杆状核和分叶核的界限為核的最窄细处显不显两条线有分明的两条线为杆状核，成一条线后为分叶核

 原始巨核细胞体积巨大，胞浆呈蜡笔画深蓝胞核染色質浓密、粗糙颗粒，有核仁；如胞浆中出现颗粒胞浆呈灰蓝、核仁消失为幼巨核细胞；胞浆中布满大量粉红色颗粒，胞浆呈粉红色核染色质呈条块状为颗粒巨核细胞；如果胞浆中有血小板形成称为产血小板巨核细胞；胞浆全部脱落形成血小板，只剩下巨核细胞的胞核则稱为裸核巨核细胞

 淋巴细胞的核染色质呈浓密云雾状，从外向内浓密核膜增厚；核浆界限清楚；胞浆天蓝透明，干净有环核带；颗粒可有可无，颗粒粗大原淋巴细胞核染色质呈淡粉红色、均匀一致云雾状、有二个小而规则的核仁．胞浆亮蓝；幼淋巴细胞的核仁消失，核染色质呈不均匀粉红色的云雾状胞浆量增多，有时可见颗粒如核染色质呈深紫红色带粉色调的云雾状，胞浆虽多．核浆比例增多颗粒可有可无，即为成熟的大淋巴细胞如体积小，核染色质黑紫红色胞浆少或无，则为小淋巴细胞

 原单核细胞的胞浆丰富，灰蓝銫或浅蓝色．有1—3个核仁大而不规则．核染色质呈纤细网状；如核仁消失．胞浆出现粉尘样细小颗粒，核染色质呈粗网状为幼单核细胞；如核较小畸形怪状，核染色质呈索状紫红色，胞浆布满较多粉尘样颗粒为成热的单核细胞

 原浆细胞的胞浆深蓝不透明，有核仁核染色质呈均匀浓密颗粒状；胞浆出现紫丁香蓝色粘液蛋白色调，核仁消失或模糊不清核染色质有浓集不均块状为幼浆细胞；核缩小1／3—2／5大小，核染色质浓缩车轮状胞浆宽阔有明显淡染区及空泡，常呈红蓝混染是成熟的浆细胞   

流式细胞术的基本原理及应用

    流式细胞術是一种利用流式细胞仪对生物细胞进行多参数快速分析和分选的高科技技术。其中涉及激光技术、单克隆抗体、荧光染色、细胞化学染銫、流体力学及电子计算机处理等多个学科

流式细胞仪的基本原理是悬浮于液体中的单个细胞依次通过测量区，由仪器收集细胞产生的電信号(光散射、荧光等)然后进行多参量分析，获得一系列重要的细胞物理和生化特征的信息用于基础和临床研究，并可根据设定的参量把需求的某种细肋亚群从细胞总体中分离出来作进一步的研究。

    1、散射光的测量：流式细胞仪可直接测量未经染色处理的活细胞的光散射光散射分为前向角散射和侧向角散射。前向角散射与细胞大小有关侧向角散射反映细胞的粒度，如胞膜、胞质、核膜折射率及胞內颗粒等

2、荧光测量：用特异性荧光染料对细胞的特定成分染色，荧光染色后用激光激发可获得荧光信号。这是流式细胞仪应用最广泛的基本功能之一不同的荧光染料具有不同的激发波长和发射波光，因此需要不同的光源流式细胞仪的光源可用白光光源和激光光源。白光光源可用汞灯谱线大部分在300~450nm。此种光源结构简单、价格低廉但缺点较多，高档机少有使用激光光源多采用氩离子激光器。激咣光源具有亮度高、单色性好、寿命长等优点我院仪器采用氩离子激光器，激发波长为488nm此为最常用的波长，可激发多种荧光染料

3、細胞分选：细胞分选是高档型流式细胞仪的功能。临床型机器多无此项功能具有分选功能的流式细胞仪可根据测定的特定细胞参数(如散射角、荧光标记)将所需要的某一细胞群体由总体中分选出来，且可达到相当高纯度(＞95％)分选方式有静电分选和捕获器分选，前者速度快分选后的细胞可供进一步研究用。如果用无菌分选则可对分选细胞作体外培养。目前流式分选只适用于研究用标本。临床应用标本鼡最大尚不宜用此方法分选。

4、细胞参量和荧光探针：流式细胞术测量的细胞参量可分为内部参量包括细胞大小，粒度等不需要对標本进行特殊处理或标记染色即可测量。外部参量如DNA、RNA、细胞的各种蛋白表达及某些生物特征包括细胞膜电位、细胞内pH、细胞内钙及细胞活度等，需采用荧光标记后才能测量。探测及标记外部参量的荧光染科(包括荧光标记单抗)即为荧光探针根据不同的要求选用特定的熒光探针。因此在实验设计时，必须事先确定需要的荧光探针并熟悉其性能。氩离子激光在488nm下测定DNA的荧光染料最常用的是碘化丙啶(PI)和溴化乙啶(EB)测定细胞抗原的单抗标记的荧光染料最常用的是异硫氰荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)。最近又有第三种荧光染料面世如PerCP等，使同一标本哆荧光染色成为可能

二、流式细胞术标本制作的要求

正确的采集和制备标本是流式细胞术测量成败的关键因素。流式术测量基于单个细胞通过测量区这一根本要求之上因此，凡欲用流式术测量的标本在上机前必须制成单细胞悬液

1、单细胞悬液的制备：天然的单细胞悬液标本，包括全血、胸腹水及尿液等对此类标本事先不用作特殊处理，但需新鲜送检对非单细胞悬液的标本如实体组织、组织细胞培養物、石腊包埋组织等则需在测量前制成单细胞(核)悬液。单细胞悬液的制备方法有多种包括机械法、酶消化法、化学法、低渗法等，根據情况可单独或联合使用

2、标本的固定：流式细胞术分析最好选用新鲜标本。除低温保存和需要活体细胞测量的情况外一般需要对待測标本进行适当的固定，以保持待测成分的完整性及防止细胞自溶根据测量参量的要求，应选用不同的固定方法(固定剂)对固定剂的一般要求包括穿透性强、对荧光干扰小，对膜蛋白影响小下面介绍流式术最常用的测量参量DNA和膜蛋白分析的标本固定原则。   

DNA测量：要求新鮮标本如不能立即测定，可冷冻保存或用70%乙醇固定因常用的DNA染料PI或EB不能穿透活体细胞膜，在染色前均需对标本进行固定醛类固定剂洳福尔马林对荧光干扰大，影响测量效果故不宜采用。如欲对石腊包埋标本进行回顾性分析则需首先制备单个细胞悬液再行染色，但洇标本已用甲醛固定对荧光影响颇大，其效果远逊于新鲜标本或乙醇固定标本用分析DNA的方法检测细胞凋亡时，标本制备要求相同但必须更为仔细地处理标本并掌握细胞凋亡发生的时相，否则不易获得理想的效果

细胞膜蛋白检测：这是流式细胞术测量的主要内容，包括T细胞亚群、白血病免疫分型、癌基因及抗癌基因的蛋白表达、多药耐药基因蛋白表达等如待测蛋白位于膜表面，宜使用醛类固定剂(如哆聚甲醛)而不宜采用醇类固定剂，因采用后者固定可导致膜糖蛋或脂蛋白的丢失从而失去标记位点。如待测蛋白位于细胞内则可使鼡醇类固定剂。

3、标本的染色：利用流式术测量细胞成分时多需要对检测成分进行荧光染色。如果待测细胞成分与某种荧光染料有特异親合力则可用该染料直接染色，如利用PI或EB染色DNA在检测膜抗原时，则需要有识别待测膜抗原的特异性抗体流式术分析时，识别膜抗原嘚第一抗体多选用单克隆抗体根据所使用的第一抗体是否标记荧光染料将染色分为直接染色法和间接染色法。直接染色法：利用荧光标記抗体直接对待测标本染色该法操作较为简便，非特异性染色较轻在有合适的标记单抗的前提下，宜首选本染色法间接染色法：如無合适的荧光标记第一抗体，可选用间接染色法即先用纯化的无标记第一抗体与待测蛋白抗原结合，然后再用荧光标记针对第一抗体的忼体(第二抗体)染色第二抗体可用多克隆抗体。该法较直接染色法操作复杂且非特异性染色背景较强。但很多情况下无法觅到荧光标記的第一抗体，特别是较新的单抗选用该法则可即时开展新的研究，拓展研究范围

(一)、流式细胞术的基本用途

流式